近年来移植免疫领域发展日新月异,与生物化学、微生物学、临床医学、生物学、遗传学、分子生物学等学科的联系日益加深,涉及范围越来越广。本文对近年来移植免疫,尤其是肾脏移植免疫方面的最新研究进展进行了综述。内容包括:慢性排斥形成的分子基础;阻断共刺激途径,诱导免疫耐受的方法;缺血/ 再灌注损伤中某些关键的分子水平的变化;凋亡在同种移植免疫应答中所起的作用;供体脑死亡对供体器官移植效果的影响以及异种移植。

　　1、 　间接同种识别途径

　　间接途径又称为间接呈递,是指受体T 细胞被受体抗原呈递细胞呈递的供体抗原多肽激活的过程。来自敲除MHC Ⅱ类抗原转基因小鼠的皮肤移植物,遭到受体小鼠的排斥。接受皮肤、心脏、肾脏移植物的啮齿类动物,其T细胞确实已被间接途径致敏;结合到受体抗原呈递细胞MHC 分子上的供体MHC多肽,在体外可以刺激该种T细胞;人类该种T细胞与心脏、肾脏同种移植物排斥有关。给啮齿类动物注射MHC抗原多肽,可以经间接途径使T细胞致敏;这些T细胞可以引起皮肤、心脏、肾脏同种移植物的加速性排斥。在某些情况下,尽管移植前去除了供体树突状细胞,也会引起移植物排斥。最新研究发现,同种识别的间接途径在慢排的发生中起重要作用。据Frasca 等[1]报道,一位HLA-A2阴性的患者接受HLA-A2 阳性供体的肾移植,最后患者因慢排而丢失移植肾。进一步行体外研究发现,该受体的T细胞对受体抗原呈递细胞体外呈递的A2抗原的应答明显增加,而来源于该患者的HLA-A2特异性T细胞株,仅有30％对共同表达DR15及A2等位基因的供体细胞应答。这一研究显示,临床上确实存在间接同种识别途径,并提示这一途径可以促进同种应答发生发展过程,并可造成移植物远期失功。

　　2、 　组织特异性抗原

　　内皮细胞特异性抗原是特异性表达在内皮细胞表面的抗原系统,它既非HLA 抗原也非ABO抗原。该抗原系统在20世纪70年代初被发现,近年又受到许多学者的重视。内皮细胞是供体组织与受体免疫系统最先接触的部位。最近研究发现,灵长类动物的内皮细胞也能表达Ⅱ类抗原,具有抗原呈递细胞的作用,可通过间接途径引起免疫应答,并能表达多种细胞因子及粘附分子。一旦在此部位出现免疫应答,将可能影响移植物血供,造成移植物损伤,最终导致移植物丢失。回顾性研究发现,内皮细胞抗体阳性者,不论其HLA 配型如何,急排和慢排发生率均明显增加。96 ％的急排、94％的慢排患者体内均能检出内皮细胞抗体,而肾功能良好的无排斥患者该抗体检出率却相当低。Sumitran-Karuppan等[2]最近报道,1例内皮细胞抗体阳性的患者接受HLA相配的肾脏移植,连续两次出现超排,并在第三次移植后不久再次丢失移植肾。可见内皮细胞抗体也可引起超排等严重排斥反应。

　　Deckers等[3]最近报道,从人类同种移植肾中分离出的T 细胞,对供体近曲小管上皮细胞和精索静脉的内皮细胞均有细胞毒作用,但对供体脾细胞却无此作用。可见人类肾移植也存在针对组织特异性抗原的同种应答。

　　移植界对HLA配型与临床效果的评价一直存在争议,并发现即使是HLA完全相同的活体亲属供肾,也有约10％发生不可逆性排斥。其原因也可能与组织特异性抗原造成的免疫损伤有关。

　　3 、　免疫效应

　　许多因素均可造成移植物损伤,如细胞因子、同种抗体、凝血过程的活化、补体途径的激活等等[4]。人们分析排斥反应,往往只注意到复杂的细胞因子网络,对凝血过程、补体途径以及高血压等其它因素重视不足。随着对排斥反应中抗原非依赖性因素所起作用的深入研究,人们逐渐注意到这些因素的重要作用。分析肾素2血管紧张素基因型变化对移植肾慢性损伤的影响,认识到高血压是移植物功能不全的重要促进因素。研究大鼠移植肾慢性排斥实验模型,发现血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ACEI) 可抑制蛋白尿的发展,但钙通道阻滞剂无此作用。Simonson等研究慢性排斥患者移植肾动脉硬化的演变过程,发现随着动脉硬化的发展,内膜区内皮素(endothelin-1,ET-1) 水平也明显升高。

　　除高血压外,其它因素也能促进慢排的发展。Brenner等详细阐述了肾单位数(nephron mass)在肾脏慢性病变发展中的重要意义,认为肾单位数是判断慢排发展的重要参数,并提示从这个角度考虑儿童肾脏也可作为供体器官。Tullius等[5]研究了大鼠移植肾急性排斥对随后慢性排斥进展的影响。将急性排斥的移植肾经过一段时间后再移植到同系大鼠,观察其结构和功能变化。结果发现,如果发生急性排斥的移植肾在五天后再移植到基因型相同的同系大鼠,受体大鼠将会死于尿毒症。此时肾组织内细胞浸润明显、并出现片状坏死。但如果在五天以内移植,移植肾却可成活。Tullius因而认为,如果发生排斥的移植物在炎症发展早期阶段就移植给同系供体,单次急性排斥可以完全逆转,不会发展成慢性排斥。尽管与临床相比这一模型还相当简单,但这一发现却相当重要。因为实验表明,如果没有随后的慢排的发展,急性排斥的同种移植肾根据其急性损伤程度的不同,有可能重新获得正常的功能。

　　4 、　缺血/再灌注损伤与免疫

　　近年Rabb等研究小组发现,短暂阻断肾动脉可以诱导内皮细胞表达粘附分子,这些内皮细胞可允许白细胞移位。通过转基因敲除或单克隆抗体灭活这些粘附分子,可减轻炎症及肾损伤。这种缺血可诱导趋化因子的产生,降低这些趋化因子也可减轻损伤。这种缺血也可引起肾脏释放细胞因子,激活内皮细胞。Jassem等研究小组发现,同系移植中缺血可诱导内皮细胞粘附分子、趋化因子及细胞因子的表达。

　　这些粘附分子、趋化因子及细胞因子可进一步引起细胞内机制、补体及凝血系统的变化。体外缺血/ 再灌注模型研究发现,缺血/ 再灌注可引起肾脏内皮细胞及小管细胞的转录因子活化,后者包括核因子κB(NF-κB)及经由应激活化蛋白激酶( stress-activated protein kinases ,SAPK) 产生的c-jun。这些转录因子进一步激活下列基因促进炎症,如IL-1α、IL-6、环氧化物歧化酶(COX2)及内皮细胞粘附分子基因[6] 。研究也证实缺血损伤激活了补体替代途径。通常这一途径是被呈现在各种细胞膜上的补体抑制蛋白DAF(CD55) 及保护素(protectin ,CD59)抑制的。再灌注损伤使细胞内钙增加,后者激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C ,该酶进一步裂解细胞表面的补体抑制蛋白。结果替代途径抑制解除, 生成C3a 及C5a ,激活内皮细胞,并引起炎症浸润。生成的C5-9膜攻击复合体刺激其它细胞释放IL-8 及血小板活化因子(PAF),后两者是趋化因子并可激活内皮细胞。缺血损伤通过激活血小板及释放PFA、趋化因子及细胞因子的单核细胞,也可启动凝血系统。

　　Kwon 等(1998)研究了术后3～7 天的同种移植肾,发现处于急性肾衰尚未恢复阶段的移植肾,其葡聚糖部分清除明显增加,伴有57 ％滤液(菊酚) 持续的经肾小管反向渗漏。电镜显示近端小管细胞的顶部及基部细胞膜破坏,但细胞表面剥脱(cell exfoliation)及小管基底膜剥离轻微。认为在持续的急性肾衰中近端小管细胞的紧密连接及细胞间粘连受损,造成了经小管反向渗漏。

　　Sims 等进一步研究缺血/ 再灌注损伤时发现,敲除IFN-γ基因的小鼠其缺血肾脏的Ⅱ类抗原的表达明显增加。Takada等研究大鼠模型发现,阻断选择素P 和选择素E 依赖性淋巴细胞的再循环对缺血的肾脏有益。对缺血/再灌注损伤认识的进一步提高,将有利于尸体肾移植中一些关键问题的解决。

　　5、 　凝血、移植物炎症与免疫

　　许多研究小组对全身性或移植物内的凝血状况进行了研究,探索移植物功能不全的可能发病机制。研究发现,有血栓形成倾向的肾移植患者与没有血栓形成倾向的患者相比,急性排斥发生率明显增加。

　　这些危险因素易导致血栓栓塞和其他突发性血管疾患。这些因素包括Ⅴ因子的Leiden突变、C蛋白、S蛋白或抗凝血酶缺陷等。一份回顾性同种移植肾免疫组化研究资料显示,20 例肾小管抗血栓素表达降低的患者,其早期移植肾功能显着下降。抗血栓素降低是移植肾功能下降的原因还是结果目前尚不清楚。有形成深静脉血栓或肾动脉、肾静脉血栓倾向的患者,可预防性应用小剂量肝素。体外研究发现,肝素和过硫化葡糖胺葡聚糖(supersulfated glycosaminoglycans)均能抑制IFN-γ刺激引起的人脐静脉内皮细胞和近曲小管上皮细胞的MHC 和细胞间粘附分子(ICAM-1)的上调。该研究提示,有低抗凝活性的过硫化葡糖胺葡聚糖能用来抑制移植物MHC 和ICAM-1 的表达[7] 。

　　移植物炎症包括对移植物的同种反应及对移植物近远期损伤的炎症反应[8]。多种细胞因子、粘附分子及趋化因子、补体等都参与炎症及免疫。最近,Henn等研究发现, 活化血小板表面的CD40配体(CD40L)可促发内皮细胞的炎症反应。Grewal等研究显示,内皮细胞表面的CD40可调节T细胞进入移植物,该CD40与T 细胞表面的CD40L相互作用后,内皮细胞的粘附分子表达增加,并释放多种趋化因子。采用抗CD40L (抗CD154)单抗或采用基因操作封闭CD40,可防止排斥。

　　6、 　凋亡、保护基因与排斥

　　当出现移植肾动脉硬化和肾小管、肾小球细胞损伤等其他慢性排斥征象时,肾脏的细胞数量和种类发生了变化并出现纤维化。通过对这些变化的发生发展的深入研究,人们正逐步认识慢排的发生机制并用于指导治疗。在大鼠主动脉同种移植物动脉硬化的发展过程中,伴随着动脉壁中层平滑肌细胞坏死,出现了与细胞毒T 细胞作用一致的穿孔素(perforin)、粘粒酶B (granzyme B)、Fas L和TNF-α的mRNA表达。在啮齿类动物发生慢排的肾脏和心脏同种移植物中,Fas L的表达也上调。实验证实采用基因工程使大鼠同种移植物表达Fas L,其颈内动脉移植物或移植肾的血管病变明显改善[9] ,同种移植肾的存活率也提高三倍。

　　研究发现,在包括慢排在内的多种移植物中发生了细胞凋亡。尽管多种途径均可引起凋亡,但急排与慢排相比更易出现细胞凋亡。Strehlau 等先后采用竞争性及半定量反转录(酶) 聚合酶链式反应(RT-PCR) ,研究了42 例同种移植肾功能减退的肾活检标本,分析同种移植肾排斥过程中的各种基因表达,结果发现,急性排斥常伴IL-5、IL-7、CTLA4、粘粒酶B、穿孔素的mRNA 的表达显着增加,而Fas L在急、慢性排斥中均上调。Sharma 等研究了80 例人同种移植肾活检标本,发现肾内Fas L、Fas、粘粒酶B、穿孔素的表达均与急排有关, 与慢排无关。Suthanthiran 等[4]研究了127 例人移植肾活检标本,发现急性排斥与移植物内IL-2、IL-10 、粘粒酶B 的表达有关,慢性排斥与TGF2β表达有关。Tang 等发现,人类移植肾慢排与尿激酶型纤溶酶原激活物受体的上调有关,这种激活物作为纤溶酶原/ 纤溶酶丝氨酸蛋白酶系统的一部分可激活潜在的TGF-β。

　　如果移植物内细胞凋亡和TGF-β等生长因子的表达是慢排的共同特征,免疫诱导能够抑制这种变化过程,充分认识前凋亡和抗凋亡途径(pro-and anti-apoptotic pathways)将对防治慢排尤为重要。Hancock等[10]研究发现,存活时间长、功能良好的同种移植物中,几种抗凋亡蛋白的表达明显增加。包括抑制凋亡的Bcl成分及抗氧化分子血红素加氧酶。Bcl成分、A20、血红素加氧酶三者统称为保护基因。它们也能抑制NFκB 的活化,能在不同的水平发挥潜在的作用,保护移植肾功能。目前正在研究利用基因工程使移植物大量表达保护基因产物。此外,缺氧(oxidative stresses ,氧化窘迫) 在慢排发展过程中的重要性也已逐渐引起人们的重视。

　　7、 　诊断和鉴测

　　由于对移植肾活检的重要性、方法及并发症缺乏正确的认识,对移植肾的病理变化及其相应检查缺乏正确的判断,以及相关检查费用昂贵等原因,我国绝大多数移植中心很少采用常规移植肾活检判断肾脏病变的性质。北美、英国、澳大利亚的多数移植中心也很少常规采用免疫组化及分子学方法进行诊断。根据临床经验来判断病情和疗效,决定增减免疫抑制剂的剂量,改变用药方案,具有相当大的盲目性。AL-Awwa等对临床及组织学诊断排斥进行了前瞻性研究,结果显示临床诊断与病理诊断完全符合仅占43％ ,部分符合占31％ ,不符合占26％。人们围绕怎样从肾活检组织中获得更多的信息,进行了深入的研究。例如采用形态测量法测量肾小球大小,有规律地间断进行肾活检获得第一手资料等。Nickeleit等[11]研究发现,特异性的动脉损伤(动脉内膜炎、纤维素样坏死、内皮细胞活化、单个核细胞贴壁) 和间质出血与抗排斥治疗反应及1年移植物存活率相关,而间质细胞浸润程度、小管炎与之不相关。有些学者强调应多次做肾活检,并建议采用细针针吸细胞学(FNA) 检查。也有学者将FNA与免疫学方法结合起来,增加其诊断价值。Oliveira等(1998) 采用FNA 获取移植物细胞,培养并测定其细胞因子的变化。结果发现术后第7天的IL-2 的水平能可靠预测即将发生的急排。David 等也报道测定FNA 获取细胞的ICAM-I 和IL2-R 表达水平,能显着增加FNA 的诊断效率。

　　除移植物活检外,患者的血液及尿液样本检测也有了进步。Schonemann等[12] 报道采用ELISA方法检测血清中的HLA-Ⅰ及Ⅱ类抗原同种抗体优于补体依赖的细胞毒试验(CDC)。Sumitran-Karuppan等[2]也报道了内皮细胞特异性抗体的检测方法。有人采用酶联免疫斑点试验( ELISPOT) 测定外周血淋巴细胞细胞因子的变化。发现有丝分裂原诱导的IFN-γ和IL-5显着增加时,高度提示急排的发生。Teppo等(1998) 研究发现IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)与IL-1β的平衡,对同种移植受者体内炎症反应的调节至关重要,可通过尿蛋白水平的变化得到反映。IL-1ra的水平升高、IL-1β水平下降较少出现急排,反之急排发生率增加。

　　8、 　治疗前景

　　免疫耐受是指机体在不存在免疫抑制状态下,对供体的特异性无反应性状态。移植前后运用单克隆抗体,短暂免疫抑制状态下输入供体抗原,或经其他途径(如口腔、胸腺) 给予供体抗原,能一定程度延长啮齿类动物的同种移植物的存活时间,但此时尚未形成免疫耐受。实验宿主如再接受移植,将排斥新的移植物。在很多情况下,长期存活的移植物存在慢性排斥的证据。因此免疫耐受的概念尚需进一步推敲。许多学者认为,在这种状态下预防慢排仍很重要。

　　共刺激途径及其封闭(通过直接针对CD40L的单抗,或采用CTLA4-Ig ,后者是CD28的同源分子CDLA4与免疫球蛋白的交联产物,能封闭CD28 ,抑制B7/CD28 的相互作用) 是目前移植免疫研究最活跃的领域之一。小鼠严格的MHC-Ⅰ类和Ⅱ类抗原错配的移植,手术第二天给于单剂量的CTLA4Ig 不能阻止慢排的发展,移植物无例外均出现动脉硬化。相反现行的CTLA4Ig 疗法(术后第一周用药4天,此后每2周用药1次) 对慢排的发展有一定的抑制作用。移植时输入供体抗原,术后第2 天给予单剂量CTLA4Ig 能显着提高同种移植物的存活率,降低慢排的发生率[13] 。目前尚不清楚这一现象的机制。

　　有人推测,间断给予脾脏等淋巴组织,通过注入B7+供体细胞,使宿主应答同步化。这样在细胞活化时宿主的应答恰好能被给予的CTLA4Ig有效抑制。Sun 等通过联合应用CTLA4Ig和CD40L单抗,加强抑制共刺激途径,证实能很有效地抑制小鼠主动脉同种移植物的动脉病变。

　　Azuma等采用次要抗原错配的F344/Lewis 大鼠进行原位同种肾移植,术后第2 天给予CTLA4Ig 封闭共刺激分子,CsA 作为对照组,发现CTLA4Ig 可预防慢排的发展。Chandraker 等[14]研究显示,延迟到出现蛋白尿时给予CTLA4Ig ,也可以预防随后的肾功能恶化,提示慢排的进展与正在进行的T 细胞活化有关。同种心脏移植术后第2 天应用CTLA4Ig 也能预防移植物动脉硬化。

　　也有学者对人和其它灵长类动物同种移植进行了干预性研究。Biancone 等发现急排与慢排肾活检组织内共刺激分子的分布不同,慢排者内皮细胞广泛表达CD40。另有研究发现,CD40 在致动脉粥样硬化中发挥关键作用,可促进内皮细胞凋亡和IL-1β的产生。Kirk 等[15]在恒河猴同种肾移植中联合应用CTLA4Ig 和CD40L 单抗预防排斥,发现4 例中2例未发生排斥,另2 例发生排斥者经再次用药后逆转。随访数月,不使用免疫抑制剂,效果满意。但目前尚不清楚其预防慢排的远期疗效。在发生排斥的人同种移植肾中也发现CD40L 基因表达增加。

　　在临床研究方面,近几年针对IL-2R (CD25)的人型化单抗的基础研究已经成熟,并开始应用于临床。移植术后最初4～6 周应用针对CD25 的单抗,能显着降低术后前6 个月的急排发生率。人型化IgG1抗CD4 单抗比IgG4 单抗更具有潜在的免疫调节能力。北美、欧洲和澳大利亚三组大规模临床资料显示,骁悉(MMF) 与安慰剂和硫唑嘌呤(Aza) 相比,能显着降低术后前6 个月移植肾急排的发生率。随访3 年,三组移植肾功能相近。但初步研究显示(Glicklich 等,1998) ,MMF 似乎未降低慢排的发生率。Jordan 等报道,术后静脉给予大剂量人免疫球蛋白,能控制心脏、肾脏同种移植物急性血管性排斥。

　　9、 　供体状态与供体器官的质量

　　实验证实,与器官供者相关的许多因素影响移植物的长期存活。Takada 等[16]注意到脑死亡尸体供者的移植器官存活率明显低于活体供者。认为脑死亡后供体器官中的前炎症介质和细胞表面分子明显增加,这一推测得到大鼠实验模型的证实。实验发现颅内压急剧增加可引起肾脏等器官中的MHC抗原、共刺激分子、多种细胞因子和化学因子明显增加。接受脑死亡大鼠交叉循环(cross-circulation ,即实验动物腹主动脉与正常动物下腔静脉相通,正常动物腹主动脉与实验动物下腔静脉相通) 的动物也出现类似结果。提示这种变化与某种可溶性因子有关。采用基因重组的可溶性选择素P(P-selectin) 糖蛋白配体Ig (ligand-Ig) 或细胞毒T 淋巴细胞(CTL)A4-Ig 可抑制这一过程。后者可封闭B7 介导的T 细胞共刺激途径。这种方法如果在人类可行,可大大提高供体器官的质量,扩大供者范围。有资料显示脑死亡供体器官的急排发生率明显增加,有必要进一步研究脑死亡对慢排的影响。

　　10、 　肾脏异种移植

　　异种移植在20 世纪90 年代后开始活跃,目前还处在实验阶段,主要研究抗体清除、补体抑制及转基因动物(如转基因猪) 。通过免疫吸附清除灵长类异种抗体,可以避免对猪等肾脏出现的超急性排斥反应。开展转基因猪研究,使猪获得一种或几种人类补体活化调节蛋白或其它调节物质,避免人类对猪肾的超排[17] 。但目前移植物存活时间均在数日至数月不等,丧失原因主要为异种排斥和免疫抑制剂的毒副作用。异种移植领域目前还存在许多问题。如寻找高效低毒的预防迟发性异种排斥的药物;建立满意的异种移植肾功能的代谢和生化方面的监测方法;弄清猪反转录病毒等致病因子移植后对人类的危险性等。Patience 等对后一情况进行了初步的预试验,2 名患者体外接受猪肾(猪肾置于体外,接通猪肾与人体间的血流) ,进行短期体外透析,未发现猪的DNA 反转录病毒感染人类。Naziruddin等[18]研究发现,等待肾移植患者血清中的抗HLA同种抗体与猪的MHC Ⅰ类抗原有交叉反应性。提示同种移植高敏患者,在接受异种移植时有可能会因体液免疫出现超排。

　　总之,移植免疫领域经过多年的实验及临床研究,已取得了重要进展,但这一领域仍在飞速发展。相信人们在不远的将来能找到恰当的免疫耐受诱导方法,找到更好的诊断和处理排斥及其他移植肾功能不全的办法。