植入前胚胎遗传学诊断（preimplantation genet?ic diagnosis，PGD）是在胚胎着床之前即对配子或胚胎进行遗传物质分析，选择没有遗传物质异常的胚胎移植。植入前胚胎遗传学筛查（preimplan?tation genetic screening，PGS）是选择染色体整倍体的胚胎进行移植，进而提高体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）的成功率。PGD和PGS避免了以往产前诊断方式可能的治疗性引产给母体带来精神和身体上的创伤，受到了广大生殖领域和遗传领域专家们的关注。1990年诞生了世界第1例PGD婴儿，至2004年，已经有超过1000个经PGD诊断的正常婴儿出生，到2010年，全球大约有10000个经PGD和PGS的婴儿出生。

　　1、 PGD和PGS适应证

　　（1）PGD适应证

　　单基因遗传病和性连锁遗传病：世界首例PGD诊断的是X-连锁隐性遗传病，Handyside等通过对胚胎性别的检测，选择女性胚胎移植，获得成功的妊娠。此后，PGD诊断了许多遗传疾病，例如囊性纤维病、地中海贫血、脊肌萎缩症、亨廷顿病等等。1999年，中山大学附属第一医院报道了中国大陆首例PGD。单基因遗传病PGD是经过遗传学检测致病基因，选择没有基因突变的胚胎移植，避免子代发病；而对于性连锁的遗传病来说，还可以通过对胚胎性别的鉴定，实现避免子代发病的可能。然而，X-连锁隐性遗传病如果选择男胚移植，虽然子代不会发病，但是理论上将有50％的男性正常胚胎被丢弃，50％的女性携带者胚胎予以保留。

　　（2）染色体疾病：染色体疾病可以分为染色体数目异常和结构异常：例如47，XXX（克氏症）、Turner 综合征（45，XO）均是染色体数目异常；而相互易位、罗伯逊易位、染色体倒位等均属于结构异常。相互易位是指两条染色体断裂后相互交换无着丝粒断片后重接，人群中发生率约为1/6×106。罗氏易位断裂发生在两个近端着丝粒染色体着丝处，断裂后两长臂染色体的着丝粒互相融合形成一个衍生染色体，发生率大约为1/1000。由于没有重要遗传物质的缺失，相互易位和罗氏易位又被称为平衡易位，智力、表型通常正常，但是在生育时，由于产生不平衡的配子会导致生育力下降、复发性流产、畸形儿等问题。通过PGD，选择正常或平衡的胚胎移植，可以解决这类人群的生育问题。

　　荧光原位杂交（FISH）技术在染色体疾病的PGD领域内应用了十余年。虽然要根据不同的染色体疾病选择探针、设计实验方案，诊断的染色体条数十分有限，但是FISH操作简便，为许多染色体疾病夫妇解决了生育问题。近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的染色体疾病PGD采用了基因芯片或二代测序技术，这些新技术不仅可以检测存在问题的染色体，而且可以检测其他全部的染色体，提供更多遗传信息。

　　（3）人类白细胞抗原(HLA)配型：对于某些血液病患儿家庭来说，通过PGD可以进行HLA选择与患儿相同配型的胚胎移植，来救治已有的血液病患儿。但是，该PGD婴儿因为其能成为“救治婴儿”而诞生，其他胚胎因为无“救治功能”而被丢弃，这些尚有伦理争议。

　　（4）线粒体疾病：大约15％的线粒体或氧化磷酸化疾病是由母系遗传的线粒体引起的DNA（mtDNA）突变。因此，通过PGD，选择mtDNA突变比率低于发病阈值的胚胎，可以降低子代发生疾病的风险。

　　 PGS 适应证：PGS是以提高妊娠率、活产率为目的的胚胎筛查方法。通过对染色体数目异常的筛选，选择染色体整倍体的胚胎进行移植。Munné等在1993 年第1 次报道了对胚胎进行PGS，此后，该应用逐年增多，欧洲人类生殖和胚胎学( ESHRE)PGD 协作组报告2009 年的PGS 达到3551个周期。

　　PGS的主要指征包括不明原因的反复着床失败、不明原因反复流产、女方高龄等。虽然对PGS的应用目前学术界尚存争议，但是大多数学者主张摒弃卵裂期胚胎FISH进行PGS。已经有许多研究结果显示，通过PGS可以增加着床率、降低自然流产率、减少非整倍体胚胎妊娠以及提高辅助生殖技术的成功率；但是仍需要多中心大样本的研究进一步证实。

　　2 、植入前诊断和筛查的取材

　　取材是PGD和PGS的一个重要步骤，它不仅要保证所获取的细胞能适用于遗传诊断的要求，而且还要尽可能地降低取材对胚胎发育的影

　　PGD的取材来源

　　（1）极体：极体是卵母细胞的副产品，对胚胎发育影响较小。极体取材可以提供的遗传诊断时间相对较长，有利于胚胎在新鲜周期移植。但是，利用极体只能推测来自母亲的遗传信息。

　　（2）分裂球：采用卵裂期胚胎的分裂球进行单细胞遗传学分析，可以同时分析来自父母双方的遗传信息，是前些年PGD工作中最主要的取材来源。但是，由于可供诊断的细胞有限以及卵裂期胚胎嵌合比例较高，目前分裂球取材所占比例在逐渐下降。

　　（3）囊胚取材：囊胚期嵌合比例显着低于卵裂期胚胎，囊胚的滋养层取材不仅获得的细胞数目增多，提高了遗传诊断的准确性，而且对胚胎损伤也相对小，近年来，越来越多的PGD和PGS周期采用了囊胚期取材技术。当然，囊胚的培养技术、玻璃化冻融技术越来越成熟以及激光仪器的发展也为囊胚取材广泛应用提供了技术保障。

　　PGD的取材方法

　　胚胎取材是PGD过程的一个重要步骤，取材是否成功直接影响到PGD的最终诊断，同时取材的过程对胚胎而言是一项损伤性的操作。取材包括透明带打孔和细胞获取2个过程。透明带打孔包括化学法、机械法、激光法。化学法由于Tyrode’s酸可能对胚胎有损伤，故目前很少采用；机械法虽然对胚胎损伤相对小，但是技术难度高，体外操作时间长，逐渐被激光法取材所取代。

　　激光法透明带打孔指通过激光发生器产生的激光能量使局部透明带熔解挥发，通过调整激光能量、作用时间及脉冲次数来控制透明带打孔的大小。

　　3、遗传诊断技术

　　（1）PCR技术在PGD中的应用：聚合酶链式反应(PCR)是利用一对寡核苷酸链做引物，引导DNA聚合酶在引物识别位点之间2条互补链上进行DNA合成，经过模板变性、退火及延伸3步为1个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，多次循环可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围。世界首例PGD即通过PCR技术完成的。

　　由于PGD和PGS的诊断材料是1个或几个细胞，DNA含量极少，很容易造成扩增失败或者扩增偏倚，严重地限制了PGD和PGS的发展。虽然许多学者发展了PCR的衍生技术，如巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等，在一定程度上拓宽了PGD诊断的范围，但是仍然十分有限。

　　近年来，单细胞全基因组扩增技术（whole ge?nome amplification，WGA）发展迅速，引领着PGD和PGS领域的大步前进。WGA 是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。目前PGD和PGS领域中应用较多的WGA技术有：简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、扩增前引物延伸反应PCR（PEP-PCR）、多重链置换扩增（MDA）以及多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）。

　　利用WGA产物进行基因芯片检测或二代测序，是目前PGD和PGS领域内应用最广泛的方法，后面将会详细叙述。单细胞PCR技术不仅对实验室的要求很高，而且还存在一些问题，比如扩增失败、污染以及等位基因脱扣等。

　　（2）FISH技术在PGD和PGS中的应用：FISH是在一定条件下将用荧光色素标记的特异DNA探针和组织细胞中待测的特异染色体序列进行原位杂交，在荧光显微镜下对杂交信号进行显示和观察，从而进行诊断。FISH在PGD中主要应用于性连锁疾病和染色体疾病的诊断。FISH技术虽然操作相对简单，无需DNA扩增，但是FISH可以检测的染色体条数有限（最多10~12条），需要根据需要检测的染色体选择不同的探针，而且有时信号判断困难。近年来，FISH技术逐渐被基因芯片技术和二代测序（next generationsequencing，NGS）技术所取代。

　　（3）基因芯片技术在PGD和PGS中的应用：基因芯片技术可以同时检测成千上万个已知基因的多态性或突变。目前，临床上主要应用的基因芯片包括比较基因组杂交芯片（comparative genomic hy?bridization，CGH）和单核苷酸多态性芯片（single nucleotide polymorphism，SNP）。CGH 是通过一次杂交对整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查，与正常人的间期染色体进行比较，再借助于分析技术对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。SNP指的是DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异。CGH和SNP技术可以检测到更细微的染色体变化，比如>3Mbp重复和缺失均可以

　　检测到。单细胞全基因组扩增技术与芯片技术的结合，可以检测单细胞或微量细胞的染色体状况。因此，CGH、SNP芯片已经在PGS和染色体疾病PGD领域中广泛应用。

　　（4）NGS技术在PGD和PGS中的应用：NGS是相对于传统的Sanger测序而言的。NGS改变了测序的规模化进程，其技术特征是不再区分单一模板，而是将模板变成了“库”，包括了需要测序的所有模板，同样是根据模板序列合成或者杂交形成互补链，通过互补链的延伸过程中引入的荧光标记来识别每个碱基。自2008年以来，全基因组测序费用呈指数级下降，这也是NGS能够进入PGD和PGS临床应用的一个重要条件。

　　提到NGS，我们还要提到一个重要的名词：测序深度。所谓测序深度是指测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小的比值，通俗地也可以理解为将基因组测了几次，它是评价测序量的指标之一。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。

　　NGS进行PGD和PGS也分为2种类型：一种是先将取材的细胞进行WGA，然后再进行NGS，这也是比较常见的方式。另一种是取材的胚胎细胞无需WGA，而是利用模仿PCR技术扩增大量的特异性片段，然后这些扩增的片段再进行NGS。

　　2013 年的ESHRE 年会上，Wells等汇报了NGS-PGS妊娠成功的病例；同年，华大基因与湘雅医院也报道了NGS 检测囊胚的PGS 成功病例。随后，多篇相关研究相继发表。NGS技术不仅在PGS中应用，通过测序深度的调整，NGS也在PGD领域内开始应用。2013年，Treff 等对6 例夫妇（囊性纤维化2例，Walker-Warburg综合征、家族性植物神经功能障碍症、X-连锁低磷性佝偻病、神经纤维瘤各1例）进行PGD诊断，遗传诊断技术分别采用其他实验室、qPCR和NGS技术分别来诊断。结果显示NGS的诊断结果与其他两种方法完全一致。2014年在北京大学第三医院生殖中心诞生了世界首例和第2例MALBAC扩增测序的PGD婴儿，分别诊断了遗传性多发性骨软骨瘤和X-连锁少汗型外胚叶发育不良。

　　NGS技术在PGD和PGS领域中的应用正在逐步发展，NGS技术最大的优点还在于它不仅可以检测胚胎的非整倍性，而且可以检测单基因疾病。这是其他技术尚不能达到的。

　　4、伦理学思考

　　虽然PGD和PGS可以避免常规产前诊断所带来的人工流产或引产，但在实际临床应用中，该技术仍然存在许多问题值得重视。PGD和PGS是通过对胚胎进行侵入性操作获得最终诊断，对子代需要长期大样本的随访。此外，PGD过程中，胚胎的弃留也存在许多争议。比如，对于X连锁的隐性遗传病进行性别筛选时，将有一半的健康男胚被丢弃，还有一半的女性携带者胚胎被保留；而对于常染色体隐性遗传病来说，杂合子胚胎是否进行移植也一直存在争议。

　　对于PGD的一些指征，也一直存在争议，比如一些家族性肿瘤(如家族性结肠息肉病、乳腺癌等)的易感性分析、HLA选型来救治已有的血液病患儿等等。

　　值得重视的是，PGD之前的遗传咨询十分重要。ESHRE对他们收集的2009年PGD数据分析，PGD的平均妊娠率只有23.04％。因此，医生应该客观地交待PGD过程及结果，而不是过分夸大其成功的结局，这样会更受到患者的青睐。要清楚地告知夫妇PGD的误诊可能，同时，也建议夫妇如果妊娠后应该进一步做常规产前诊断。PGD的诊断不应随着胚胎移植入母体而结束，而要继续随访至产前诊断乃至对日后出生的婴儿也应该继续随访。Kalfoglou等的调查表明，即使PGD误诊，最终导致致病婴儿出生，医院对其随诊也将明显改善患者的满意度。

　　综上所述，单细胞的遗传诊断技术日新月异，引领着PGD和PGS领域快速前进。如果说1978年LouisBrown的诞生划时代地开启了人类辅助生殖技术的新篇章，那么单细胞遗传诊断技术的飞速发展则为许多存在着遗传疾病高风险的夫妇带来了福音与新的希望。近年来，欧洲和美国都相应制定了PGD和PGS的技术指南或建议，我国卫生和计划生育委员会也发布了《关于辅助生殖机构开展高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断临床应用试点工作的通知》，相关部门也已经着手制订详细的技术规范。随着单细胞遗传诊断技术的不断发展与完善，相信越来越多存在着遗传疾病高风险的夫妇将会从中受益。