Survivin和VEGF-C联合检测在高发区食管鳞癌预后中的作用

　　摘要

　　目的：研究Survivin和VEGF-C联合检测在高发区食管鳞癌预后中的作用。方法：采用免疫组化方法检测Survivin和VEGF-C蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况。83例食管鳞癌患者均为林州市居民，随访在5年以上,术前未接受放疗及化疗。结果：Survivin阳性表达组和VEGF-C阳性表达组患者的5年生存率均明显低于阴性表达组(P<0.05)。根据Survivin和VEGF-C表达情况，探索性建立的分子水平多因素分级模型显示：0、1和2三个级别组患者的5年生存率有明显差别(χ2=32.20，P<0.001)。结论：联合检测Survivin和VEGF-C表达可以提供较准确的预后信息，可能有助于临床评估患者预后和制定个体化的治疗方案。

　　目前，组织分化程度和TNM分期是临床医师判断食管癌患者预后的主要指标。但是，临床上经常发现肿瘤组织分化程度或TNM分期与预后不一致的病例，比如：组织分化程度较高的患者预后并不比分化差的患者好，同一分期的患者预后可能明显不同，提示单纯从形态的改变判断患者预后，存在一定的局限性。分子肿瘤学的发展为肿瘤预后的研究提供了新的手段，从分子水平探索食管癌侵袭转移相关基因的变化，寻找敏感、特异的预后指标，提供个体化的预后信息，对于临床及科学研究工作都有重大意义。本研究应用免疫组织化学方法检测Survivin和VEGF-C在食管鳞癌中的表达情况，探讨两者与食管癌患者预后的关系，为临床医师更确切的评估患者预后和实施个体化治疗提供帮助。

　　材料与方法

　　1.研究对象：标本来自1998-1999年河南省林州市肿瘤医院胸外科手术切除、病理科存档的食管鳞癌蜡块。以临床病理资料和随访调查资料完整的83例林州市食管鳞癌患者为研究对象，其中原位癌13例，进展期癌70例;男57例，女26例。年龄38-76岁，平均年龄59.82±7.42岁。术前未接受放射或化学治疗等抗肿瘤治疗。临床病理特征分析参照《新编常见恶性肿瘤诊治规范・食管癌和贲门癌分册》(中国抗癌协会，1999)，由林州市肿瘤医院病理科提供。pTNM分期参照国际食管癌TNM分期方案(UICC/AJCC，1997)。

　　2.组织处理：所有组织均经体积分数为10％的福尔马林固定、石蜡包埋。蜡块标本连续4μm切片，平贴在涂有APES的载玻片上，作免疫组织化学染色。

　　3.试剂与方法：兔抗人Survivin多克隆抗体(sc-10811),工作浓度：1：175，购自Santa Cruz
Biochemology,Inc;兔抗人VEGF-C多克隆抗体(ZA-0266),工作浓度：1：100。采用Pv-9000二步法非生物素免疫组化检测试剂盒,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。具体操作按说明书严格进行。所有切片均经0.01M柠檬酸缓冲液作高温高压抗原修复。一抗均4℃过夜，PBS代替一抗作为空白阴性对照。

　　4.结果判定标准：以胞核或胞质出现棕黄色染色为阳性表达。每例切片高倍镜下(×40)计数至少5个随机视野，取平均值。阳性细胞数小于等于5％为阴性表达;大于5％为阳性表达。

　　5.统计方法：应用SPSS10.0软件进行数据处理。Survivin蛋白表达与临床病理因素之间的关系采用x2检验或Kruskal-Wallis检验。2个变量相关性分析采用Spearman等级相关分析。对食管癌患者的生存资料进行Kaplan-Meier分析，生存率比较用Log-rank检验。将性别、年龄、浸润程度、淋巴结转移、分化程度、pTNM分期、Survivin表达7种因素作为自变量，生存时间作为因变量，量化后进行拟合Cox模型逐步回归分析。显著性水准α定位0.05。

　　结 果

　　1.Survivin表达及其与食管癌患者预后的关系：Survivin阳性产物主要位于细胞核，呈棕黄色。胞核呈阳性表达的有31例，胞质胞核共表达有12例，未见单纯胞质中表达。Survivin阳性表达率为43/83(51.8％)，阴性表达率为40/83(48.2％)，13例早期癌均为胞核表达(见图1)。40例Survivin表达阴性患者中2例死于冠心病、22例死于肿瘤复发和转移，43例Survivin表达阳性患者中2例死于脑梗塞、32例死于肿瘤复发和转移。Kaplan-Meier生存分析显示：Survivin表达阳性组和阴性组患者的平均生存时间(月)及95％可信区间分别为37(30,44)和49(42,57)(见表1)。Survivin表达阳性组患者的5年累积生存率为25.58％，阴性组患者的5年累积生存率为44.74％。Log-rank检验：Survivin阳性表达组的5年生存率明显低于阴性组，差别有统计学意义(χ2=5.78，P=0.0162)(见图2)。

　　2.VEGF-C表达及其与食管癌患者预后的关系：VEGF-C阳性产物大多数呈细颗粒状弥漫分布于胞质中，大部分染色较弱(见图3)。83例鳞癌组织中VEGF-C阳性表达率为45.8％(38/83)，阴性表达率为54.2％(45/83)。38例VEGF-C表达阳性患者中37例死于肿瘤复发和转移，45例VEGF-C表达阴性患者中4例死于心脑血管意外、17例死于肿瘤复发和转移。Kaplan-Meier生存分析显示：VEGF-C表达阳性组和阴性组患者的平均生存时间(月)及95％可信区间分别为26(23,29)和57(50,64)，(见表2)。VEGF-C表达阳性组患者的5年累积生存率为2.63％，阴性组患者的5年累积生存率为62％。Log-rank检验：VEGF-C阳性表达组的5年生存率明显低于阴性组，差别有统计学意义(χ2=41.65，P<0.001)(见图4)。

　　3.Survivin和VEGF-C联合检测食管鳞癌的预后：Survivin阳性表达、VEGF-C阳性表达是影响高发区食管鳞癌患者术后长期生存的因子。如果一种分子指标在某例组织中的表达状况是与食管癌预后不良有关则评为1分，相反的表达评为0分，将几种指标在每例组织中评分结果相加，得到该例患者的总分。最后按0分、1分、2分等分值归类建立多因素分级，举例如表3。结果见表4。可以通过分子指标的紊乱程度来评估癌细胞的恶性程度。从Survivin、VEGF-C两个指标所建立的多因素分级的生存曲线图5可以看出：高发区食管鳞癌患者的术后生存时间与多因素分级即分子的紊乱程度是相匹配的，评分越高恶性程度越高，生存期越短。三级的生存期有明显差异(χ2=32.20，P<0.001)。

　　讨 论

　　Survivin是肿瘤凋亡抑制蛋白(inhabitor of apoptosis protein,IAP)家族的一名新成员，是1997年Ambrosini G等利用效应细胞蛋白酶受体-1的cDNA在人类基因组库中筛选克隆出来的。目前研究认为，Survivin蛋白可能同时具有调控细胞凋亡和细胞增殖的双重功能。作为IAP家族中的成员，Survivin主要通过抑制胞浆中Caspase-3和Caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程[1]。但有反对者认为Survivin的结构难于和Caspase-3直接结合，提示Survivin的抗凋亡作用可能不是通过抑制胞浆中的Caspase-3的活性实现，而是通过胞核中的其他途径[2]。有研究[3]认为，Survivin可以依赖细胞增殖信号介导而进入核内，与细胞周期调节因子CDK4结合，形成Survivin-CDK4复合体，使P21蛋白自CDK4释放，P21进一步与线粒体中Caspase-3结合，抑制其活性，进而抑制细胞凋亡。同时，作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI)重要成员的P21的解离使周期蛋白依赖性激酶CDK4活化，形成周期蛋白CyclinD和CDK4复合物，促使细胞通过G1期进入S期，促进细胞增殖[3-4]。VEGF-C是血管内皮生长因子(VEGF)家族的新成员，近年来发现其有促淋巴管增殖作用，故又被称为淋巴管生长因子。它通过作用于淋巴管内皮细胞受体Flt-4，诱导淋巴内皮细胞分化、增殖和迁徙，导致淋巴管增生[5-8]，是肿瘤细胞和周围淋巴管内皮细胞之间相互旁分泌的重要调节因素，在淋巴结转移的发生中起着重要的作用。

　　由于组织分化程度和TNM分期在判断食管癌患者预后中的局限性，寻找与食管癌患者预后相关的分子指标，从分子水平评价食管癌患者的预后是肿瘤临床工作者的重要任务。本研究发现，Survivin阳性表达组和VEGF-C阳性表达组患者的5年生存率明显低于阴性表达组。食管癌的预后不良涉及多种因素、多个分子指标，由于不同分子指标在食管癌组织中的表达频率、表达强度和结果判断标准均有很大差异，而且免疫组化这种实验方法本身也有一定局限性，所以很难决定哪个分子指标是评估食管癌预后的最佳指标。因此将多个分子指标相结合，综合评价食管癌患者的预后，将是降低错误机率的较好方法。本研究中我们探索性应用Survivin和VEGF-C两个指标建立两因素分级，通过分子指标的紊乱程度来评估患者的预后。研究发现，高发区食管鳞癌患者的术后生存时间与分子紊乱程度是相匹配的，两因素分级中各级曲线区别更明显，能更明确反映病情和预后。提示，两因素分级可以帮助临床医师选择TNM分期较低但高分级水平的病例给予术后辅助治疗;也可选择TNM分期较高但低分级水平的病例免于无益的治疗而造成身体和经济的损失，使临床治疗方案个体化。

　　生物分子水平的多因素分级从肿瘤生物学特性的角度来评价食管癌患者的预后，较传统的从形态学的角度TNM分期来评价食管癌患者的预后，显示出其独特的优越性，为临床医师判断患者病情和预后提供了一条新的途径和方法。我们的研究只是探索性的初步尝试，为建立标准化的食管癌多因素分级提供参考和帮助。建立标准化的食管癌多因素分级是一项艰巨的任务，需要筛选出合理的分子指标以及免疫组化的标准化等工作，同时又需评价其与TNM分期的关系如何，能否取代TNM分期等。我们认为将TNM分期与分子水平的多因素分级相结合应用于临床实践，会在延长肿瘤患者生存期和提高生活质量方面发挥更大作用。