材料和方法：

　　材料:实验于2011年7月至2012年4月在北京市心肺血管疾病研究所-省部共建心血管重塑重点实验室完成，实验选取清洁级BSL-C57小鼠购自北京市维通利华实验动物公司，胎牛血清、LG-DMEM培养基购自GIBICO公司。

　　方法：

　　1、细胞分离培养：

　　取4周龄C57小鼠脱颈椎处死,取出股骨和胫骨,分离去除肌肉组织，无菌条件下暴露骨髓腔,用无菌DMEM培养液反复冲洗骨髓腔内的细胞,200目尼龙网过滤除去较大的组织团块。将收集的细胞悬液离心1000rpm离心时间5min,重悬细胞后接种到含有10％FBS的LG-DMEM培养基中,24h内更换培养基，以后隔天换液，在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中进行原代细胞培养(P0)，细胞铺满瓶底90％时,0.25％EDTA-胰酶消化，按1：2传代培养(P1,P2,P3,…)。隔天更换培养基，通过倒置显微镜下观察记录细胞形态变化。

　　2、流式细胞仪鉴定:

　　取培养至第5代细胞,用0.25％EDTA-胰酶消化后,用PBS溶液调整细胞浓度为1×107/ml。取5个流式管,分别加入100µl细胞悬液后,再加入PE-anti-CD90、PE-anti-CD34、FITC-anti-CD45、FITC-anti-CD73荧光标记抗体和设置空白细胞作为对照，震荡后,4℃孵育30min,PBS洗2次,过滤除去细胞团块，进行流式细胞仪检测。

　　3、细胞心肌补片制作与鉴定：

　　将经过环氧乙烷消毒处理的补片使用打孔器将补片材料裁剪成0.5cm直径的圆形补片，使用培养基浸润补片，等到补片完全培养基浸润后使用PBS缓冲液冲洗3次，放入96孔板备用，保持细胞补片平整，细胞种植前使用培养基进行浸润24h后移去培养基基，将培养至5代细胞后的细胞使用0.25％的胰酶消化后计数每孔1×105个细胞种至补片。

　　A、电镜标本制作：

　　共培养的标本经去离子水洗涤3次后，使用0.25％戊二醛500μL固定，浸没细胞补片置于4℃保存，制成扫描电镜标本后上机检测。

　　B、荧光标记法观察细胞生长增殖情况：

　　将小鼠BMSC制成浓度为1×107L-1的细胞悬液后接种至24孔板(每孔含体积分数10％FBS的DMEM培养液500μL)，每个材料标本设置3个孔。置于体积分数5％的CO2、37℃、饱和湿度培养箱内培养24h，细胞贴壁后弃培养液，使用多聚甲醛固定10分钟，PBS清洗3遍后将补片置于载玻片上，DAPI液滴于补片上，加盖盖玻片后与荧光倒置显微镜下观察并拍照每个孔选取10个视野进行计数取平均值，对每个材料进行数据统计。

　　数据处理：

　　细胞计数使用SPSS12.0统计学软件分析，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。流式细胞术鉴定结果使用EXPOTM32ADC软件分析。

　　结果：

　　1、BMSC的光镜下：

　　BMSC在光镜早期细胞形态多样，多呈圆形、椭圆形、杆状或者梭形4-6天左右呈“集落”样生长,细胞扩增迅速,放射状、旋涡状向外扩展,两三周达80％～90％融合,数次细胞换液后悬浮细胞已被清除，3～5d即可达80％～90％融合,贴壁细胞均一性增加，呈纺锤状,且增殖旺盛,保持旋涡状生长方式。

　　2、细胞流式鉴定：

　　取第3代BMSC，流式细胞术鉴定，结果为CD34、CD45阴性,CD90弱阳性，CD73阳性。

　　3、电镜扫描结果：

　　扫描电镜下PU材料制成的补片表面类似颗粒样聚集形成的不规则表面，表面细胞形态正常，数量较多，分布不均匀，可见少量细胞碎片等细胞裂解)材料是有纤维交织而成的网状结构，具有三维立体结构，孔隙均匀，细胞生长良好，形态呈不规则形，未见明显细胞碎片等细胞裂解物;PPC材料制成的材料表面光滑偶有凹陷，表面细胞数量极少，有部分细胞碎片等细胞裂解物。

　　4、荧光标记细胞核后倒置显微镜下计数：

　　细胞补片荧光显微镜400倍下，细胞计数平均数，PU材料组143.78±38.38、P(3HB-co-4HB)材料组159.50±33.07和PPC材料组1.40±0.70。SPSS12.0软件方差分析得出PU组和P(3HB-co-4HB)组之间细胞计数的平均值没有统计学差异(P=0.942)，PPC组与PU组(P1)及P(3HB-co-4HB)组(P2)之间的细胞计数平均值有统计学差异(P1=0.000、P2=0.000)。

　　讨论：

　　BMSC是一种比较原始的骨髓基质细胞,骨髓来源的间充质干细胞具备较强的分化潜能,可能通过横向分化为心肌细胞、细胞融合、直接分化为内皮细胞、平滑肌细胞参与血管形成[13，14],旁分泌作用激活内源性的修复机制发挥修复受损心脏的作用[15]，使得科学家们开始广泛关注MSCs在组织修复和基因治疗中的临床应用。因其具有心肌和血管修复潜能的优点,成为心肌组织工程研究中种子细胞来源的热点之一。细胞心肌成形术主要通过细胞移植治疗心肌梗死，但是细胞移植后存在随着血流的冲刷细胞和心脏机械活动造成移植细胞流失[16]。因而，寻找一种能够为细胞提供良好生存环境并具有一定的物理学特性和良好的生物组织相容性以及可体内降解吸收的材料来提高移植细胞在心肌梗死区域的存活和增殖，从而更好地改善预后。

聚氨酯(PU)最早是由德国化学家发明，并与上世纪50年代引入国内并迅猛发展，聚氨酯弹性体可在较宽的硬度范围具有较高的弹性及强度、优异的耐磨性、耐油性、耐疲劳性及抗震动性。聚氨酯具有优异的综合性能，已广泛用于纺织、印刷、医疗、体育、粮食加工、建筑等部门。

3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯(P(3HB-co-4HB))是一种新型的第三代PHA材料，因其良好的物理性能引起了广泛的关注。清华大学化工系高分子研究所实验室发现并合成P(3HB-co-4HB)作为新型的组织工程材料。研究表明P(3HB-co-4HB)呈现生物相容性及降解吸收特性比PHB更优越。

　　本研究尚存在不足之处，虽然细胞能够P(3HB-co-4HB)材料制成心肌补片材料上存活，并且P(3HB-co-4HB)材料可以具有良好的生物组织相容性及可降解吸收特性，但是补片材料降解吸收对机体的影响尚待研究，补片材料的植入对机体免疫系统的影响尚不明确，P(3HB-co-4HB)材料作为心肌补片的可行性及进一步的生物毒性和功能仍需进一步的研究。

　　综上所述，在细胞心肌补片的选择中存在不同的研究，实验中干细胞能够顺利种植到PU材料和P(3HB-CO-4HB)材料制成的补片上，但是由于PU材料的不可吸收特性，使其在医学生物材料领域的使用受到限制，而P(3HB-co-4HB)材料是一种新颖的生物材料，具有良好的生物组织相容性和物理特性，在生物体内具有可吸收性，可以作为细胞心肌补片材料的很好选择，但P(3HB-co-4HB)材料作为心肌补片的可行性及进一步的生物毒性和功能还需要进一步的研究。