脑胶质起源的肿瘤是中枢神经系统的最常见肿瘤，也是人类难治性肿瘤，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）最具代表性，因其不同肿瘤间以及同一肿瘤内部变化多样和不均一性（heterogeniety）的组织形态学，又被冠以多形性胶质母细胞瘤的称谓。近二十年来，随着认识的不断深入，GBM的不均一性已经不仅指其组织学表现形式，还指其不均一的生物学行为（增殖与凋亡、血管形成与侵袭迁移），更延伸到不均一性的治疗反应[1,2]。纵贯于整个上世纪九十年代，GBM的不均一性仅归因于肿瘤细胞的基因表型变化。脑肿瘤干细胞的发现是神经肿瘤学研究的一个重要事件，深刻影响了我们对GBM的发生模式、肿瘤的不均一性、肿瘤细胞与微环境关系，以及治疗策略的科学研究[1-3]。

　　一、脑肿瘤干细胞鉴定与筛选

　　急性髓细胞白血病中仅约0.01％～1％的肿瘤细胞能够通过实验性移植诱导出白血病，这是肿瘤干细胞存在的首先证据[2]。随后，乳腺、结肠、胰腺、肺等实体肿瘤中也发现了肿瘤干细胞[4]。在高级别原发性脑肿瘤中，如胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、神经母细胞瘤，也发现肿瘤干细胞；在低级别脑肿瘤中尚无肯定发现[5]。脑肿瘤干细胞表现出和神经干细胞类似的特点，如自我更新能力，无血清培养基中形成细胞球，表达干细胞标志和多谱系分化潜能；脑肿瘤干细胞和神经干细胞所不同的是其分化标志异常表达、染色体异常且具有肿瘤形成能力[5]。如果说在脑肿瘤干细胞研究领域什么是最亟待确立和规范的，当属脑肿瘤干细胞的鉴定与筛选，关乎整个脑肿瘤干细胞的理论体系。实际上，有关脑肿瘤干细胞研究结果彼此不符甚至完全矛盾，肿瘤细胞亚群的分离和富集方法与步骤的不同是重要原因之一。

　　在GBM中最常使用的细胞表面分子标志是CD133、A2B5、CD5、CD171、ITGA6和EGFR[3]。CD133、A2B5、CD15为尚未发现明确生物学功能的代用标志，CD171、ITGA6和EGFR属功能性标志[3]。免疫磁珠分选和荧光激活细胞分选（fluorescenceactivatingcellsorting，FACS）正是利用这些分子标志进行肿瘤干细胞的分离。

　　我们以CD133为例，说明利用肿瘤干细胞代用标志的方法学对解读研究结果的影响。CD133最早用于造血干细胞和神经干细胞的分离，也广泛用于脑肿瘤干细胞的鉴定和分选[6,7]。在GBM中，CD133+细胞与CD133-细胞相比，在NOD-SCID鼠颅内种植，具有肿瘤发生能力[3]。但也有研究报告了不同的结果，无论从GBM组织标本还是体外培养的细胞系中，所分离的CD133-细胞也具有肿瘤形成能力[8,9]。这种不一致的结果可能由方法学缺陷造成。首先，同FACS法相比，免疫磁珠分选法缺乏特异性，分选所得的CD133+细胞中会混有和免疫磁珠非特异性结合的CD33-细胞，所富集的并非只是CD133+细胞[10]。类推，“CD133-细胞具有肿瘤形成能力”的结论，也可能是CD133-细胞在分选中混入了CD133+细胞[11]。当然，标准化的细胞纯化判定方法和设计严格的内对照实验有助于排除细胞的混淆因素。再者，胶质瘤基质中的内皮细胞表达CD133，从肿瘤组织中分离的CD133+细胞中会含有CD133+的内皮细胞，在移植模型中CD133+细胞的生长优势则会超过CD133-细胞。但最近有研究报告，即使排除了内皮细胞的影响，FACS纯化的CD133+细胞和CD133-细胞也都具有在裸鼠内促进肿瘤生长的能力[11]。用于肿瘤干细胞分选的抗CD133抗体类型包括抗CD133/1和抗CD133/2二种抗体，分别识别CD133跨膜蛋白的二种不同糖基化表位，因而也会影响研究结果间的一致性[12]。方法学缺陷造成实验结果的不一致同样存在于A2B5、CD15等代用分子标志[3]。

　　发现和优化既能够作为肿瘤干细胞富集标志，又能作为治疗靶点的功能性标志是一个重要研究方向。我们以表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）为例做进一步说明。EGFR是神经干细胞的标志[13]，在调控脑室下区神经干细胞的分裂和干性维持方面具有相关作用[14,15]。分子神经病理学早已发现，EGFR在60％以上的原发性GBM中表达，而在继发性GBM中不表达，具有一定的诊断和预后意义。在同一GBM肿瘤标本中，EGFR+肿瘤细胞的分布是不均匀的，提示EGFR可以作为区别GBM中细胞亚群的分子标志[16]。从人GBM组织标本和肿瘤干细胞系中经FACS分离GBM细胞亚群，其中EGFR+细胞亚群无论是否与CD133和CD15共表达，都表现出最恶性的分子和功能表型[3]。通过功能获得或丢失改变肿瘤干细胞系细胞中EGFR表达，会相应出现促进或抑制细胞生长作用。显然，EGFR表达是胶质瘤形成的必要条件，不仅可以作为胶质瘤细胞亚群的功能标志，还可以作为GBM的治疗靶点。研究还发现，EGFR-肿瘤细胞亚群在移植性肿瘤形成过程中可以出现EGFR的再表达，提示干细胞标志的表达调控是动态过程。新近又有研究证明，肿瘤细胞亚群的动态维持在黑色素瘤和GBM中确实是存在的[17,18]。

　　二、脑胶质瘤的肿瘤发生理论

　　复杂的肿瘤细胞构成是动态变化的，肿瘤细胞增殖、侵袭和专化中不断需要进行细胞的重新补充，这一过程引起的肿瘤不均一性有两种解释机制，即：等级模式(hierarchicalmodel)和随机模式（stochasticmodel）。

　　等级模式是指肿瘤发生和维持需要很少的一部分具有“干性”的细胞亚群，也就是肿瘤干细胞。肿瘤干细胞自我更新失控而无限增殖和迷乱分化；由肿瘤干细胞分化而来的多数肿瘤细胞不具自我更新的能力，而对肿瘤永生化无显著作用。肿瘤的不均一性是因肿瘤干细胞和其分化而来的后代细胞共存而造成。随机模型是指肿瘤内多数细胞都有能力自我更新，对肿瘤的发生和维持均有作用。肿瘤的不均一性主要是因肿瘤细胞克隆之间分子遗传及表观遗传不同而造成。更重要的是，随机模型认为肿瘤内所有肿瘤细胞均具有肿瘤形成能力，尽管某种程度上，肿瘤形成过程也需要细胞团队共同来维持；肿瘤内所补充细胞表型的不同，反应了肿瘤转化和恶变不同阶段所存在的细胞克隆[19,20]。

　　最初的多项研究证明，在造血系统恶性肿瘤、乳腺癌、结肠癌中，仅仅一小部分肿瘤细胞亚群具有形成新肿瘤的能力，是等级模式强有力的支持[21]。但陆续有研究质疑，等级模式是否适合于所有肿瘤类型。Kelly等2007年发现，从三种不同的原发性造血系统肿瘤小鼠模型中分离的细胞，超过10％具有在非照射接受鼠上诱导出肿瘤的能力[22]。Shmelkov等2008年报告，在小鼠结肠癌中CD133-细胞也具有肿瘤形成能力[23]。与此呼应，单细胞移植分析发现人类黑色素瘤中肿瘤起始细胞超过25％。胶质母细胞瘤中最近也有类似报告。事实上，等级模式可能比较适合于造血系统肿瘤和若干实体肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌以及髓母细胞瘤，这些肿瘤的起源组织中的细胞都有严格和明确的等级[11,18]。相反，GBM的起源组织具有间质样的构筑，如神经嵴和成熟脑，可能需要随机模式和高度灵活的肿瘤发生模式。在GBM中，存在多组活跃的肿瘤起始细胞，每组都可以通过特异性的标志蛋白表达和不同的功能表型或基因分子特点（侵袭、促血管形成、或增殖）来区分。肿瘤发生的随机模式可能比等级模式更合适来解释GBM的内在不均一性，但不能认为应该完全除外等级模式。最近在白血病研究中就提出，等级模式和随机模式并不是互相排斥的，肿瘤细胞演变会同时受两种模式管理[11]。

　　三、胶质瘤干细胞的微环境

　　如果把肿瘤当作一个微生态系统来认识，不仅存在不同细胞克隆间的关系，还存在肿瘤细胞与微环境的关系。在这个协同作用系统中，肿瘤细胞克隆彼此间竞争性获得氧气、营养和空间，通过自然选择致强者胜出；系统在肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间创造的局部微环境来促进肿瘤的生长、侵袭、细胞凋亡和/或治疗抵抗以及免疫逃避。脑肿瘤的微环境成分包括小胶质细胞、巨噬细胞、星形细胞、少突细胞、神经元、胶质和神经元祖细胞、细胞外基质、周细胞和内皮细胞[1]。GBM细胞容易沿着有髓轴突、血管基底膜或室管膜下侵袭，说明了微环境对肿瘤细胞侵袭迁移的影响[24]。胶质瘤细胞和微环境中的内皮细胞相互作用，对维持肿瘤干细胞的“干性”状态非常重要[25]。在异种原位移植模型中，内皮细胞或血管增殖可以使具有自我更新能力的细胞群扩增并加速肿瘤生长。相反，通过厄洛替尼（erlotinib）靶向抑制EGFR下调VEGF，或贝伐单抗直接中和VEGF，可以降低肿瘤生长和减少具有自我更新能力的细胞数目。

　　肿瘤干细胞的维持和存活既有内在调控机制，即通过增殖和存活通路调控，包括c-Myc,Oct4(POU5F1)、Olig2和Bmi1[26]，又有发生在肿瘤所处微环境或小生境（niches）的外在调控机制，即通过生长因子及与细胞基质的相互作用调控。研究已经证明，肿瘤干细胞和他们所处微环境之间的相互通讯，能够影响GBM中的细胞命运[27,28]。但肿瘤细胞和微环境之间的相互作用还远没有弄清楚。在快速生长的胶质瘤中，我们仍然不清楚肿瘤细胞建立了自己的微环境，还是已存微环境来募集肿瘤干细胞？肿瘤细胞和基质之间是怎样的一种双向作用关系？肿瘤干细胞在肿瘤侵袭前缘的作用以及同免疫系统的相互作用如何？深入的研究肿瘤干细胞和微环境之间的通讯机制，对于肿瘤干细胞对肿瘤发生、生长、维持、侵袭和治疗抵抗都有帮助，并藉以发现对恶性胶质瘤更有效的治疗策略。

　　免疫缺陷鼠常用于肿瘤干细胞的体内研究，但免疫缺陷鼠不能复制免疫系统成分，而这种成分存在于肿瘤病人并对细胞等级的形成具有重要驱动作用[5]。免疫缺陷状态下可能会允许某些肿瘤细胞生长，也失真于病人体内的真实情况。基因工程修饰鼠模型可以产生同基因宿主，但相对缺少细胞的不均一性，而且不同种属细胞间因子信号的不同仍是肿瘤干细胞研究的挑战。应该说，目前尚没有一个模型系统能够完全代表人体条件下各种各样的分子遗传和表观遗传的变化，并忠实的反映肿瘤干细胞和所处微环境之间的相互通讯特点。

　　四、对治疗的提示

　　分子靶向治疗与传统的细胞毒性药物相比，具有低毒和高效的特点，可以对现有治疗方法进行互补，但恶性胶质瘤的第一代靶向治疗试验结果并不令人振奋。事实上，靶向药物的单剂治疗在复发性恶性胶质瘤中并不成功。显然，肿瘤增殖细胞亚群的不均一性是影响临床治疗反应的重要原因之一[11,18]。例如，使用小分子的酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TK）抑制剂来抑制EGFR激酶域可作为GBM的治疗策略，但迄今仅有的几项临床研究报告均证明，单用EGFR抑制剂仅对GBM仅部分有效[29]，原因是在PTEN突变的肿瘤中，存在高水平的Akt依赖性信号，以及在同一肿瘤细胞中存在多种TK的共激活[30,31]。事实上，高度恶性的EGFR+GBM细胞对TK抑制剂确实有反应，选择EGFR作为治疗靶点是合理的，只是在同一肿瘤中EGFR+细胞和EGFR-细胞共存，而EGFR-细胞对治疗的无反应导致肿瘤复发[11]。发展多靶向联合抑制策略，同时靶向抑制多个分子和细胞，有望克服GBM部分细胞亚群对治疗的抵抗[3]。

　　针对恶性胶质瘤的不均一性特点，进一步的治疗策略应该考虑如下方面：

　　（1）继续寻找能够选择性地识别GBM各细胞亚群的分子标志，尤其是功能性的分子标志，不仅可以作为潜在的治疗靶点，还可预计治疗反应和预后[32]。

　　（2）通过大宗临床肿瘤标本的基因组和转录谱调查，把基因型和细胞谱系发生相结合用于恶性胶质瘤的分型，不仅可以促进理解肿瘤不同细胞亚群间功能的不同，还可以发现治疗的新靶点[33]。

　　（3）用最少的基因标签在GBM中识别肿瘤细胞亚群，前瞻性预计病人对特定靶向治疗是否获益，实现GBM的个体化和最优化治疗[13,34-36]。

　　（4）GBM的有效治疗策略应该把GBM“舞台上的所有演员”都考虑在内，而且牢记GBM的不均一性应该认为是个动态的过程，具有特定分子标志的GBM细胞亚群也具有时效性或窗口期，必须按照均衡考虑的治疗策略和时间序贯采取治疗手段[3]。