一、术前准备

　　同纤维支气管镜(纤支镜) 术前准备,常规在纤支镜气道检查后于活检刷检前做BAL。局部麻醉剂为2 ％利多卡因。

　　二、BAL 操作技术

　　1、灌洗部位选择:对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B1 或B5 ) 或左肺舌段,局限性肺病变则在相应支气管肺段进行BAL。

　　2、BAL 操作步骤: 首先在要灌洗的肺段经活检孔通过一细硅胶管注2 ％利多卡因1～2ml ,做灌洗肺段局部麻醉; 然后将纤支镜顶端紧密楔人段或亚段支气管开口处,再经活检孔通过硅胶管快速注入37 ℃灭菌生理盐水,每次25～50ml ,总量100～250ml ,一般不超过300ml ; 立即用50 ～100mmHg(1mmHg = 0. 133kPa) 负压吸引回收灌洗液, 通常回收率为40 ％～60 ％; 将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液,并记录总量;  装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附) ,置于含有冰块的保温瓶中,立即送往实验室检查。

　　支气管肺泡灌洗液(BALF) 实验室检查

　　一、BALF 细胞总数和分类计数检测

　　1、将上述回收灌洗液装入塑料离心管内, 在4 ℃下以1 200r/ min 离心10min ,上清(原液或10 倍浓缩) - 70 ℃储存,用做可溶性成分的检测。

　　2、经离心沉淀的细胞成分用Hank’s液(不含Ca2 + 、Mg2 + ) 在同样条件离心冲洗2 次, 每次5min。弃去上清后加Hank’s 液3～5 ml 制成细胞悬液。也可以应用灌洗原液以减少细胞丢失。

　　3、在改良的Neubauer 计数台上计数BALF 中细胞总数,一般以1 ×109/ L表示。如果细胞数过高时,再用Hank’s液稀释,调整细胞数为5 ×109/ L ,并同时将试管浸入碎冰块中备用。

　　4. 细胞分类计数:采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5 ×109/ L) 100μl ,在4 ℃下以1 200 r/min 离心10 min ,通过离心作用将一定数量的BALF 细胞直接平铺于载玻片。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30 min 后进行染色,一般别Wright 或HE 染色。

　　5、在40 倍光学显微镜下计数200个细胞,进行细胞分类计数。

　　二、BALF 中T 淋巴细胞亚群的检测

　　1、采用间接免疫荧光法,将上述获得的BALF 细胞成分,用10 ％小牛血清RPMI 1640 培养液3～5ml 制成细胞悬液。

　　2、将细胞悬液倒人平皿中,置于37 ℃5 ％CO2 培养箱中孵育2h ,进行贴壁处理,去除肺泡巨噬细胞。

　　3、取出细胞悬液,再用Hank’s 液冲洗离心1 次,弃上清留20～100μl 。经贴壁处理后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少,淋巴细胞相对增多。

　　4、将经贴壁处理的细胞悬液分装3个小锥形离心管内,每管20～30μl ,用微量加样器向标本中加单克隆抗体CD3 ,CD4 和CD8 各20～40μl ,混匀置于4 ℃冰箱中作用1～2h。

　　5、取出标本,先用Hank’s 液冲洗离心2 次,以12 000 r/ min 离心20s ,然后加羊抗鼠荧光抗体各20～40μl ,置于4 ℃冰箱作用30min。

　　6、取出标本用Hank’s 液以同样速度和时间离心冲洗2 次,弃上清留20μl充分混匀细胞,取1 滴于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数200 个淋巴细胞并计算出标有荧光细胞的阳性率。

　　几点说明:

　　1、用于做支气管肺泡灌洗的纤支镜顶端直径应在5. 5～6. 0mm 左右,适紧密楔人段或亚段支气管管口,防止大气道分泌物混入和灌洗液外溢,保证BALF 回收量。

　　2、在灌洗过程中咳嗽反射必须得到充分的抑制,否则易引起支气管壁粘膜损伤而造成灌洗液的混血,同时影响回收量。

　　3、一份合格的BALF 标本应是:BALF 中没有大气道分泌物混入;回收率> 40 ％ ,存活细胞占95 ％以上;红细胞< 10 ％(除外创伤/ 出血因素) ,上皮细胞< 3 ％～5 ％;涂片细胞形态完整,无变形,分布均匀。

　　4、由于BALF 中可溶性成分检测受诸多检测因素影响,如灌注量和回收量、肺泡上皮通透性等,致使肺泡衬液稀释度亦有所不同。尽管在做BALF 可溶性成分检测时采用内或外标记物进行标化,但检测结果仍存在着差异,其临床价值有限, 故本草案未做有关BALF 液性成分检测方法的规范。

　　5、本规范不适于少量液体做支气管冲洗(BL) 和全肺灌洗技术的操作。

　　6、健康非吸烟者BALF 细胞学检测正常参考值: (1) 细胞总分数:细胞总数(0. 9～0. 26) ×109/ L ,其中肺泡巨噬细胞0. 93 ±0. 03 ,淋巴细胞0. 07 ±0. 01 ,中性和嗜酸细胞均< 0. 01。(2) T 淋巴细胞亚群:总T细胞(CD3+ ) 0. 7 ,T辅助细胞(CD4+ ) 0. 5 ,T 抑制细胞(CD8+ ) 0.3 ,CD4+ / CD8+ 比值1. 5～1. 8。