人工关节假体周围的颗粒可引起巨噬细胞的募集和吞噬，巨噬细胞吞噬颗粒后发生活化，释放一系列细胞因子，形成炎症性肉芽肿，最终导致骨溶解和松动。假体周围存在多种颗粒，包括UHMWPE颗粒、钛合金颗粒和骨水泥颗粒等，临床组织学观察发现，不同材质的颗粒诱发骨溶解的强弱程度不同，其中以UHMWPE颗粒的作用最强。目前对这种因颗粒材质不同而造成局部生物学反应差异的确切机制尚不明了，也缺乏相关实验研究。巨噬细胞吞噬颗粒是假体周围骨溶解反应的初始步骤，吞噬反应越强其活化程度越高，引起的炎症和骨溶解反应也越强。据此作者推测颗粒诱发骨溶解程度的差异与颗粒引起巨噬细胞吞噬反应程度的不同有关，本实验假设不同颗粒引起巨噬细胞吞噬反应不同，对比观察UHMWPE和Ti-6AL-4V两种颗粒引起的巨噬细胞吞噬反应的差异，从细胞水平探讨不同材质颗粒引起的不同生物学反应差异的原因。

　　颗粒与细胞

　　1、颗粒：UHMWPE颗粒由美国John D. Dingle VA医学中心的Wooley H.教授惠赠。颗粒形态不规则，平均直径2.6μm（直径范围0.8-23μm，）。Ti-6AL-4V颗粒由上海第二医科大学附属第九人民医院骨科实验室制作，专利号03142073.7。制作过程是将Ti-6AL-4V材料制成的磨块装入相同材料的磨罐中，无菌条件下加入70mL的DMEM，置于摇床上震荡摇晃21天，采用梯度离心法提取DMEM内的颗粒。制作的Ti-6AL-4V颗粒形态多变，平均直径3.9μm（直径范围0.6-31μm，）。为去内毒素，将颗粒悬溶于75％乙醇，室温下震荡洗浴4 次，每次1 小时，100％乙醇浸泡过夜。经检测内毒素含量小于0.25EU/mL。处理后的颗粒悬浮浸泡于培养基中。

　　2、RAW 264.7细胞：RAW 264.7细胞（购自上海中科院细胞研究所）属于小鼠单核/巨噬细胞系，同时具有巨噬细胞和破骨前体细胞的双重特性，在37℃、5％CO2条件下培养于含10％胎牛血清和1％青/链霉素的DMEM中。根据颗粒的不同实验分2组，在培养基中分别加入UHMWPE颗粒和Ti-6AL-4V颗粒，调整浓度至0.1mg/mL，使RAW 264.7细胞在颗粒刺激条件下进行培养。

　　RAW 264.7细胞对两种颗粒吞噬情况的对比观察

　　1、测定最佳细胞反应密度：本实验采用MTT法寻找细胞对颗粒的最佳反应密度。将巨噬细胞（RAW 264.7细胞）分别以1×103/mL、1×104/mL、1×105/mL和1×106/mL的密度与UHMWPE颗粒和Ti-6AL-4V颗粒进行共同培养，72h后进行MTT细胞活力检测。结果显示，密度为1×105/mL的RAW264.7细胞对0.1mg/mL浓度颗粒的刺激最敏感。

　　2、颗粒吞噬的观察：将密度为1×105/mL的RAW 264.7细胞分别与0.1mg/mL的UHMWPE颗粒和Ti-6AL-4V颗粒进行共同培养，光镜下观察培养后第1、4、12、48和72h细胞吞噬颗粒的情况。并在第1、4、48和72h在100倍光学显微镜视野下计数每个视野内含吞噬颗粒细胞占总细胞数的比例，重复3次，同时进行统计学分析。

　　统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行卡方检验，以р＜0.05为有统计学意义。

　　结果

　　巨噬细胞吞噬UHMWPE颗粒 UHMWPE颗粒刺激巨噬细胞产生的吞噬反应快速而强烈。RAW 264.7细胞与UHMWPE颗粒接触后仅1h，即有部分细胞开始吞噬颗粒。随培养时间延长，吞噬颗粒的细胞越来越多，到48h，96.4％的细胞内含有吞噬的颗粒。72h后吞噬颗粒的细胞达到饱和，含有吞噬颗粒的细胞比例不再增加。同时可以观察到，细胞吞噬颗粒后自身不但不增殖，相反表现出胞体增大、煎蛋样外形和细胞脱落等凋亡现象。如此时更换为普通培养基，含有吞噬颗粒的细胞继续凋亡脱落，而剩余少量的未吞噬颗粒的细胞开始增殖，直至铺满整个培养皿。

　　巨噬细胞吞噬Ti-6AL-4V颗粒的情况 与UHMWPE颗粒相比，Ti-6AL-4V颗粒引起巨噬细胞吞噬现象出现的较晚，而且吞噬颗粒的细胞比例相对较少，这种现象在培养早期更显著。在RAW 264.7细胞与Ti-6AL-4V颗粒共同培养后1h，很少有细胞吞噬颗粒的现象。在培养后4h，有少量细胞吞噬颗粒。随培养时间延长，吞噬颗粒的细胞逐渐增多，但比例与同时间段的UHMWPE颗粒组相比明显较少。到72h，有70％以上的细胞含有吞噬颗粒。吞噬颗粒的细胞形态变化较小，很少有脱落凋亡表现。

　　讨论

　　UHMWPE是引起骨溶解的主要颗粒 人工关节假体周围存在多种磨损颗粒，如UHMWPE颗粒、钛合金颗粒、骨水泥颗粒、纯钛颗粒和钴铬钼颗粒等，可引起假体周围生物学反应，经一系列病理变化，最终导致骨溶解和松动。临床组织学观察表明，假体周围最常见、数量最多的是UHMWPE颗粒，与假体周围生物学反应的关系较其它颗粒更密切，是引起骨溶解和松动的最主要颗粒：当界膜内的UHMWPE颗粒超过1×1010/g时，几乎肯定发生骨溶解和松动，假体使用寿命明显缩短。UHMWPE颗粒较其它颗粒更易引起骨溶解的原因目前尚未完全阐明。

　　颗粒与巨噬细胞的关系 颗粒导致骨溶解和松动的主要机制是刺激假体周围细胞产生生物学反应，造成局部生化环境改变和骨代谢失衡。巨噬细胞是体内主要的防御反应细胞，与颗粒之间存在着最直接和密切的关系。根据组织学观察，固定良好的假体周围界膜内仅有少量颗粒和巨噬细胞存在，而松动假体局部增厚的界膜内含有大量颗粒，同时募集有大量巨噬细胞吞噬颗粒，巨噬细胞的数量与颗粒的数量和体积成正比，说明颗粒能够引起巨噬细胞募集在假体周围并被其吞噬。本实验结果也表明，巨噬细胞与UHMWPE颗粒接触仅1h即开始吞噬，随时间延长吞噬明显增加，验证了巨噬细胞确有吞噬颗粒的能力。

　　巨噬细胞吞噬颗粒后活化，发生一系列反应，在使周围生化环境发生改变的同时自身也出现性状改变。首先，巨噬细胞在吞噬颗粒后分泌多种生化介质和细胞因子，包括TNF-α、IL-1、 IL-6和 MMP等，引起假体周围炎症性肉芽肿和骨吸收的反应。其次，巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，在颗粒刺激情况下，分化成破骨细胞的数量增多，骨吸收能力增强，引起局部骨代谢不平衡，造成假体周围骨溶解。实验证明，巨噬细胞的上述生物学变化必须在与颗粒接触或吞噬颗粒后才能发生，如阻止颗粒与细胞间的接触，将不会发生上述变化。

　　UHMWPE颗粒与钛合金颗粒吞噬反应比较 本实验研究表明，与Ti-6AL-4V颗粒相比，UHMWPE颗粒能够引起巨噬细胞快速而强烈的吞噬反应。UHMWPE颗粒与巨噬细胞刚接触即被吞噬，且随时间延长，吞噬现象越来越明显，含有颗粒的细胞的比例迅速增加，到72h就已经达到吞噬呈饱和状态。而在Ti-6AL-4V颗粒组，细胞吞噬现象出现较晚，在相同时段内，含有吞噬颗粒细胞的比例也明显少于UHMWPE颗粒组。

　　以往的研究认为，UHMWPE颗粒之所以是导致骨溶解发生的主要因素，主要在于其数量众多，远远超过其它颗粒数量的总和，因此引起的生物学反应更强。而本实验结果表明，即使在颗粒密度相同的情况下，UHMWPE颗粒刺激巨噬细胞的吞噬作用仍较钛合金颗粒更强烈和迅速。由于巨噬细胞需要在吞噬颗粒后才会发生生物学反应，因此可以推测UHMWPE颗粒本身引起的巨噬细胞的吞噬和生物学反应也较其它颗粒更强，产生更多的炎性介质和细胞因子，这从另外一个角度解释了UHMWPE颗粒较其它颗粒更易诱发骨溶解的原因。

　　总之， UHMWPE颗粒较Ti-6AL-4V颗粒引起的巨噬细胞吞噬反应更快更强烈，并由此引起一系列生物化学反应，最终导致更强的假体周围骨溶解反应和松动。