水通道蛋白在体内广泛分布，具有特殊的分子结构和生物学特性，属膜主体内在蛋白(Major Intrinsic Protein, MIP)家族成员,具有增加细胞膜水通透力的功能,可以提供快速液体转运的途径。其中，AQP-5主要表达在Ⅰ型上皮细胞的顶膜，其主要功能是参与水转运及腺体分泌，与气道高反应性有关。

　　单肺通气技术(one-lung ventilation，OLV)广泛应用于胸科手术中，可以为术者创造良好的操作条件，减少肺部并发症，避免手术侧肺的分泌物或渗出物流入健侧通气肺，但OLV过程中常引起肺内分流增加导致低氧血症等改变，肺水肿也是其严重并发症之一。因此，研究单肺通气与AQP-5的关系具有一定的临床参考意义。近来，有人主张左主支气管结扎法和气管插管过深法建立兔OLV模型。

　　因大鼠支气管与血管结合紧密且脆弱易破极难将两者分离，我们分别采用左侧主支气管连同血管一并夹闭[4]和气管过深插管建立两种大鼠单肺通气模型，通过免疫印迹法定量检测各组大鼠AQP-5表达的变化，研究AQP-5在OLV过程中与急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)的关系，探讨缺血再灌注损伤在AQP-5表达变化中所起的作用。广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科黄冰

　　1、材料和方法

　　1.1 实验动物和分组：SD大鼠60只，广西医科大学实验动物中心提供，雄性，体重200～250g。分为夹闭左侧肺门OLV组(A组)，过深插管OLV组(B组)，双肺通气对照(C组)，空白对照组(D组)。A、B、C组分别按不同通气时间再分三个亚组，A1组：OLV0.5h，复张0.5h，总通气时间1.0h;A2组：OLV1.0h，复张0.5h，总通气时间1.5h;A3组： OLV1.5h，复张0.5h，总通气时间2.0h;B1：OLV0.5h，复张0.5h。

　　总通气时间1.0h;B2组： OLV1.0h，复张0.5h，总通气时间1.5h;B3组：OLV1.5h，复张0.5h，总通气时间2.0h;C1：双肺通气1.0h;C2：双肺通气1.5h; C3：双肺通气2.0h。用excel随机函数表随机分配，各亚组和空白对照组每组6只。

　　1.2主要试剂： AQP-5兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司(1:10000稀释)，羊抗兔二抗和GAPDH内参抗体购自Santa Cruz公司(1:500稀释)，PVDF 膜购自大连宝生物有限公司。

　　1.3实验模型的建立

　　1.3.1 实验动物的麻醉和监护 实验大鼠予肌注氯胺酮80mg/kg，速眠新2(第二军医大学研制)0.6～0.8ml/kg，取仰卧位，予颈部及左侧胸部备皮，固定四肢。待大鼠进入完全麻醉状态，沿颈部正中纵向切开，暴露气管，于第一环状软骨下缘气管切开，置入气管导管(自制)约2cm，给予维库溴铵2mg/kg，待呼吸渐微弱至停止(约5分钟)接呼吸机(江湾Ⅰ型微型动物呼吸机)，VT10ml/kg，RR60次/min，纯氧接入。

　　除空白组外所有大鼠均于麻醉诱导后行颈动脉穿刺置管监测心率和有创血压，体表血氧探头检测血氧饱和度。血压能够较平稳地维持于80/60mmHg～140/110mmHg(1mmHg=0.133kPa)之间，血氧饱和度维持在90％～100％，心率约200～400次/min。

　　1.3.2实验动物模型的制作　轻柔操作，将大鼠置于右侧卧位。于左侧胸第五肋间开胸，去除第五肋部分肋骨，暴露肺叶。A1、A2、A3组将左侧肺门部以套胶皮管的微型血管钳夹闭，立即调节VT至5ml/kg,RR80次/min，见左侧肺叶不张，可良好地观察到右肺3、4叶，开始计时，复张时除去血管钳，调节VT至10ml/kg,RR60次/min，约5min～10min后肺复张良好。

　　B1、B2、B3组于暴露肺叶后将气管导管推进至3.0cm～4.0cm处，使导管进入右侧支气管，调节VT为5ml/kg,RR80次/min，见左侧肺叶不张，可良好地观察到右肺3、4叶，开始计时，复张时将气管导管退回至2cm处，调节VT10ml/kg，RR60次/min，约5min后肺复张较好。C1、C2、C3组于暴露肺叶后，可见肺膨胀良好，开始计算时间。

　　其OLV过程有时有少量漏气，可观察到非通气侧肺有点状通气，如漏气较严重时需要对导管稍作调整。

　　1.3.3 实验动物的标本采集和保存 空白组予相同方法麻醉后迅速处死，其余各组达到预定通气时间后立即处死，因需比较相同部位及两侧对应部位的肺组织，分别取部分左肺下叶和部分右肺第3、4叶肺组织，4％多聚甲醛固定48h，脱水后石蜡包埋。取余下左肺下叶和右肺第3、4叶肺组织置于液氮罐中迅速冷冻，并转移至80℃低温冰箱保存。

　　1.4蜡块5μm厚切片，HE染色光镜观察。

　　1.5免疫印迹分析AQP-5表达的变化 低温下取肺组织(50±5)mg，剪碎加入预冷的6倍体积的RIPA裂解液和1:300的蛋白酶抑制剂，匀浆后10000r/min离心5min，取上清液。

　　用BCA标准曲线法测定蛋白浓度，样品1:4体积加入×SDS2PAGE上样缓冲液，70℃水浴10分钟，GAPDH为内参，SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜，一抗(1:10000)孵育，4℃过夜，洗膜，加入二抗(1:500)，常温孵育一小时，洗膜后暗室曝光，胶片显影，用QUANTITY ONE图像分析系统对扫描后的蛋白条带图像进行分析，数值越大，表示灰度值越大。

　　1.6 统计学处理 以AQP-5目的蛋白条带的灰度值和内参GAPDH蛋白条带的灰度值的比值做统计学分析。

　　应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料均以`x±s表示，各组数据服从正态分布并满足方差齐性要求，比较A、B、C组组内各亚组及D组有无差异、相同时点各亚组有无差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各亚组左右两侧比较、各亚组及空白对照组组间两两比较采用 LSD-t检验，检验水准=0.05, P<0.05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　2.1 肺组织大体观察 ①D组大鼠肺组织，肺组织呈现萎陷状态，浅红色，质均匀。② C组肺组织大体呈粉红色，质均匀。③A组，非通气侧复张较好，复张过程中有少部分肺组织复张不良，呈点状或小块状暗红色，复张良好肺组织呈粉红色，通气侧肺组织均匀呈粉色。④B组大体与夹闭一侧肺OLV相近。各实验组及双肺通气组肺组织随通气时间的增加有肿胀趋势，但外观无明显肺水肿。

　　2.2 光镜观察

　　①D组大鼠肺泡腔清晰，肺泡大小均匀，间隔纤细，毛细血管内可见血细胞。

　　②C组可见肺组织肺泡间隔增宽，随通气时间增加，肺间隔增宽明显，部分肺泡腔内出现少量红细胞，通气时间2.0h各亚组可见毛细血管扩张充血，部分肺泡壁破裂，肺泡腔融合，腔内可见红细胞，呈肺水肿表现，左右两侧变化一致。

　　③A组的变化与C组相近，通气侧肺组织变化较非通气侧轻，主要表现在非通气侧肺泡腔内红细胞数量较多。

　　④B组的变化与C组相近，通气侧与非通气侧变化差别不大。

　　2.3 Western blot结果显示：结果如表1及图1、图2所示。D组肺组织AQP-5呈较高水平的阳性表达，均高于A、B、C组内各亚组(P<0.05)。

　　各亚组左右两侧肺AQP-5的表达无统计学差异(P>0.05)。A、B、C组组内各亚组比较差异均有统计学意义(P<0.05), A1、B1、C1组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);A2、B2、C2组间比较，A2组较B2组和C2组AQP-5的表达减少(P<0.05)，B2组和C2组无统计学差异(P>0.05);A3、B3、C3组间比较，A3组、B3组均表现出与C3的区别(P<0.05)，且A3组比B3组AQP-5的表达减少(P<0.05)。

　　3、讨论

　　AQP-5是肺组织液体快速转运的通道,对维持肺组织的正常生理功能起着重要作用。急性肺损伤(ALI)是指机体遭受严重感染、创伤、辐射、休克等打击后, 出现的以弥漫性肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管内皮细胞膜损伤为病理特点的综合征。胸科手术中存在手术损伤、机械通气性损伤、氧化应激反应、液体超载，麻醉药物、细胞因子等致ALI病因。

　　有研究表明，促进AQP-1和AQP-5的表达，可以加快肺水的运输和清除，提高水的平衡，消除肺水肿，从而有效地防治急性肺损伤，李波等研究得出的结论认为AQP-1和AQP-5可能参与ALI液体的异常转运，与肺水肿的发病机制有关，我们从实验大鼠的肺组织病理切片观察到，随通气时间的延长，肺组织出现了肺水肿征象，这与通气过程中的ALI关系密切，提高AQP-5的含量或者活性，可能有利于消除肺水肿，对防治ALI有积极的意义。

　　OLV可使肺内分流增加，这时产生缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)是机体维持通气和血流比相适应的代偿性保护机制。本实验中A组单肺通气时阻断了一侧肺的血流，这时单肺通气过程并没有增加肺内分流，理论上此时该侧肺不需要HPV代偿机制，阻塞解除后，萎陷的肺达到良好复张的一段时间内同时存在HPV代偿机制和缺血再灌注损伤机制。

　　B组在行单肺通气时即可发生HPV,减少肺通气侧血流，调节通气/血流比，萎陷的肺达到良好复张的一段时间内仅存在HPV代偿机制，无缺血再灌注损伤机制。有人在实验中观察到再灌注后肺组织超氧化物歧化酶(SOD)含量进行性下降，并认为肺缺血再灌注损伤可能与肺内细胞因子释放增加,中性粒细胞聚集、激活、氧自由基产生和清除失衡有密切关系。

　　此外，缺血时间的长短，与再灌注损伤的发生与否有关，OLV时肺非通气侧由于阻塞导致缺血或HPV导致低灌注，肺随阻塞去除而复张同时伴随肺组织的再灌注可导致氧自由基的产生，通气侧则可能同时受到高氧、容量伤和低灌注导致的的复合损伤。我们的实验结果显示各亚组左右两侧肺AQP-5的表达变化是一致的，即夹闭侧与对侧的变化程度相当，由此可见AQP-5的调节在此体现于全肺组织。

　　实验组和双肺通气对照组与空白对照组相比AQP-5蛋白表达下降，表现出与机械通气时间相关，单肺通气较双肺通气AQP-5表达下降，且夹闭方式比过深插管方式更早出现AQP-5的下降，在此缺血再灌注损伤机制可能对AQP-5的下调起到了一定的促进作用。

　　综上所述，机械通气可引起AQP-5表达的下调，单肺通气下更加明显，且与时间相关。夹闭法单肺通气较插管过深法单肺通气AQP-5表达的下调出现更早程度更大。