验对象与方法

　　检测对象

　　实验病例组

　　2012年1月至2013年10月期间，在我院神经外科手术的36例脑胶质瘤患者作为实验组，年龄从12 岁～65 岁，平均39.6岁，其中男20例，女16例。排除感染性疾病、神经系统疾病、肿瘤、自身免疫性疾病，其肝、肾功均正常且无外伤和其他慢性病史。所有病例均由我院病理科确诊为神经胶质瘤病人，依据WHO脑肿瘤分级将所有胶质瘤患者分为低级别组（I～II级）和高级别组（III～IV级）。严格按照腰椎穿刺操作规范，实验组患者分别留取术前24小时，术后24h,术后72h 和术后120h之内脑脊液。采集脑脊液后，立即行脑脊液常规生化检查，剩余标本在4℃4 000×r/min离心10 min后，收集上清液立即置于-80℃冰箱保存（有红细胞者弃用）。对照组处理方法同手术组。

　　正常对照组

　　选取同期18例门诊健康体检人群为对照组，年龄26～65岁，平均38.8岁，男10例，女8例。其性别构成和平均年龄与实验组比较差异无显著性（P>0.05）。

　　实验方法

　　采用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA 法）测定，标本测定严格按照试剂盒说明书操作，根据试剂板上各孔的OD 值与空白孔OD 值的差值作为纵坐标，以标准品浓度作为横坐标绘制相关曲线；依待测标本的OD 值查得其浓度。

　　统计学处理

   所有数据均以均数±标准差（±SD）表示， 采用统计学软件SPSS17.0对数据进行分析， 应用t检验及单因素方差分析比较各组间差别和组内不同时间点的差别，P0.05代表有统计学差异。

　　实验结果

　　胶质瘤患者CSF中IL-6、IL-10、MMP-2、MMP-9的水平与对照组相比，所有测量值的组间有显著差异

　　高级别与低级别胶质瘤CSF中IL-6、IL-10、MMP-2、MMP-9水平差异

　　按WHO脑瘤分类标准（1997）诊断，36例胶质瘤病例中，中低度恶性胶质瘤17 例（以下简称I～Ⅱ 级组）（包括星形细胞瘤I、Ⅱ级14例，室管膜瘤1 例，少支突细胞瘤2例），高度恶性胶质瘤19例（以下简称Ⅲ级以上）（包括星形细胞瘤Ⅲ、IV级14 例，间变型室管膜瘤2例，间变少支突细胞瘤1 例，髓母细胞瘤2 例）。

　　高级别组胶质瘤患者脑脊液中MMP-2、MMP-9 、IL-6 的水平显著高于低级别组。而脑脊液中IL-10的水平在高级别组与低级别组之间无显著性差异

　　胶质瘤患者术后IL-6、IL-10、MMP-2、MMP-9随时间的变化

　　本实验测得胶质瘤患者脑脊液中MMP-9水平在术后24小时内迅速下降；MMP-2和IL-10水平在手术后不同的时间点无明显变化；术后脑脊液IL-6水平后逐渐降低

　　讨论

　　脑胶质瘤（glioma）是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，因其易复发常需要进行多次手术，并且术后可能会遗留偏瘫失语、智力低下以及精神疾病等严重残疾，给家庭带来了无尽的痛苦和灾难。高级别脑胶质瘤如胶质母细胞瘤和间变性胶质瘤等表现为弥漫性浸润生长，平均生存期只有1年多。传统的治疗方法如手术和放化疗等都致力于缩减肿瘤，肿瘤的复发几乎不可避免。从胶质瘤生物学上的关键特点例如侵袭性和免疫抑制等作为切入点来进行研究是目前的研究热点，而不仅仅是从大体上切除瘤体；虽然脑胶质瘤的研究已经取得巨大的进步，但中位生存期却仅仅提高了9.10周[2]。因此，基于脑胶质瘤发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点就显得十分迫切和必要。

　　IL-6和IL-10在胶质瘤患者中的表达及意义

　　血脑屏障对免疫细胞的相对不可穿透性，中枢神经系统缺乏淋巴系统，以及中枢神经系统的小胶质细胞和固有巨噬细胞相对无免疫活性等，长期以来，大脑一直被认为是一个“免疫豁免器官”。中枢神经系统内若存在主动免疫将为胶质瘤的治疗提供了新的方向，即利用特异性的免疫治疗开发更有效的胶质瘤治疗方案。对于研究者来说，胶质瘤免疫治疗既能够杀伤靶胶质瘤细胞，而又不损害正常组织，显得更具有吸引力和研究前景。然而，最近Wheeler等进行的I期和II期临床试验却表明，尽管树突状细胞疫苗对复发胶质母细胞瘤患者很安全，但是治疗效果却并不让人满意[3]。现在已经知道，免疫治疗以及免疫系统对肿瘤细胞靶向作用的失败，主要是因为一些与脑胶质瘤相关的免疫细胞因子的失调所致；这些细胞因子导致了脑胶质瘤患者的免疫抑制和免疫逃避，并促进肿瘤细胞增生和血管生成，从而增加了肿瘤的侵袭性，促进了肿瘤进展，以及导致了对各种治疗的耐受性。

　　IL-6和IL-10作为治疗脑胶质瘤的新靶点而受到广泛关注。近年来，已经有证据表明高级别的脑胶质瘤细胞比低级别脑胶质瘤细胞能分泌更多这类细胞因子，表达水平和肿瘤恶性程度之间存在相关性[4]。我们分别比较了不同级别胶质瘤患者CSF中IL-6和IL-10表达的水平，也发现它们的水平与恶性程度之间具有一定的相关性。最近，Samaras等提供的免疫组化染色结果表明，在GBM中的IL-6表达主要局限于肿瘤细胞和巨噬细胞，且位于大块的缺血坏死区内。

　　IL-6是一种多效细胞因子，在许多生理和病理过程中发挥作用，包括炎症反应、骨代谢、C反应蛋白合成以及血细胞生成等。IL-6可由多种类型的细胞分泌，并且作用于多种靶细胞，调节细胞发育、分化以及诱导与数种疾病相关的特异性基因。研究已经发现脑胶质瘤中有不同程度的IL-6基因扩增和mRNA表达，提示脑胶质瘤侵袭与IL-6基因表达之间有明显的相关。IL-6也是VEGF表达的一种潜在的刺激因子，而后者在脑胶质瘤的发生发展中是主要的促内皮细胞分裂因子。

　　本实验采用ELISA 法测定实验组和对照组脑脊液中IL-6水平，测定了它在手术前后不同时期的变化，并进行统计学分析，结果显示实验组CSF中IL-6水平较对照组显著增高，证实了胶质瘤患者存在炎症因子的异常激活，提示胶质瘤患者机体存在慢性炎症损伤状态。我们也比较了不同级别胶质瘤患者CSF中IL-6的水平，其与胶质瘤恶性程度呈正相关。脑脊液中IL-6水平手术后逐渐减少，可能是因为分泌释放减少，分解代谢增多等原因，目前，炎性细胞因子在神经损伤和修复中的作用仍有争议。

　　目前包括脑胶质瘤在内的多种肿瘤中发现了IL-10表达增多。有研究已经证实 [5]，IL-10在恶性肿瘤中比在良性肿瘤中的表达水平高，体外实验中发现IL-10能够增强胶质瘤细胞系的增生和侵袭力，且这种作用呈剂量相关性。他们认为，在胶质瘤患者，IL-10的主要来源是小胶质细胞和巨噬细胞是而非肿瘤细胞[6]。多个研究发现，IL-10可通过下调主要组织相容性抗原复合物II（MHC II）的含量而降低单核细胞的抗原提呈作用，从而阻碍了T细胞的抗原激活性增生和其他炎性介质的分泌。在动物模型中，IL-10却可以增强特异性的抗肿瘤免疫反应，这使IL-10对免疫系统的作用产生了争议。有数据证明，IL-10作为一种免疫调节剂而非免疫抑制剂，在产生抗GBM效应性T细胞的过程中发挥着十分重要的作用[7]。

　　本实验采用ELISA 法测定IL-10水平，并进行统计学分析，结果显示了实验组脑脊液中IL-10水平较对照组显著增高，也证实了胶质瘤患者存在炎症因子的激活。我们也比较了不同级别胶质瘤患者CSF中IL-10的水平，数据显示无明显差异，它不能作为肿瘤级别评定的参考指标。IL-10在胶质瘤患者手术前后脑脊液中120小时内无明显变化，可能是由于其清除效率低或持续释放，没有发现它增多或明显减少的变化，也可能是我们的研究的时间较短，有待下一步继续研究。

　　MMP-9和MMP-2在胶质瘤患者中的表达及意义

　　MMPS是一个蛋白酶家族，主要作用是降解细胞外基质和基底膜等结构，这种酶功能的发挥需要Ca2+和Zn2+等离子的参与。在炎症反应、肿瘤侵袭转移等多种情况下MMPS表达量会明显上升，并且其表达水平、TIMPS及其它抑制因子的调节及自身的负反馈调节等很多因素都可能会影响MMPS作用的发挥。

　　虽然MMP-9及MMP-2都归于基质金属蛋白酶家族，但是它们在同一胶质瘤患者的表达量却有很大的不同。我们分析造成这种差异的原因，可能与它们的来源不同密切相关，但是它们的确切来源还不明确，也可能与分子量、释放及清除动力学等因素相关。有研究[8]显示在脑缺血再灌损伤2h后它们的表达量会明显升高，我们认为这种蛋白酶可以通过破坏内皮细胞之间的紧密连接并分解脑微血管的基底膜而导致BBB的开放。血脑屏障的破坏和脑微血管通透性增高会引起脑水肿，可以推测MMP-2和MMP-9与临床预后密切相关。

　　MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，可分解明胶，Ⅳ，Ⅴ型胶原和弹性蛋白等多种蛋白[9]。本实验研究发现胶质瘤患者脑脊液中的MMP-9水平显著高于对照组，高级别组患者MMP-9的表达显著高于低级别组，脑脊液中的MMP-9水平随着肿瘤恶性程度的增高而增高，MMP-9的表达可能成为胶质瘤恶性程度、侵袭能力以及预后判断的重要指标。

　　在MMP-9表达量的研究中值得注意的是，它在脑脊液中的表达量在手术后会突然降低， 这种特性在其他检测的生物标记物中没有表现出来，这可能与载瘤状态解除有关，也提示它有可能来源于肿瘤细胞本身或肿瘤刺激周围正常细胞产生。MMP－9与肿瘤的存在状态密切相关，可以作为胶质瘤患者预后的参考指标，是否与肿瘤大小具有相关性，有待进一步研究，如果具有相关性，将为临床提供更大的参考价值。

　　MMP-2是MMP家族中的重要成员，可水解弹性蛋白、层粘连蛋白和纤粘蛋白等蛋白质，而它们是构成内皮细胞之间紧密连接和毛细血管壁基底膜的主要成分。分解了这些蛋白质就会引起基底膜通透性增高和BBB结构的破坏，从而引起脑组织水肿、颅内压增高等病理损害。

　　本实验研究发现，MMP-2在正常对照组中低表达，在胶质瘤中的表达明显增高，且在高级别和低级别组中的表达差异具有统计学意义，但差异并不突出，提示MMP-9在胶质瘤的侵袭性生长过程中可能起着更重要的作用。

　　综上所述， MMP-9、MMP-2、IL-6及IL-10可能在胶质瘤的免疫和侵袭中起主导或决定性作用。胶质瘤患者脑脊液中IL-10的水平在高级别组与低级别组之间无显著性差异，不能作为胶质瘤级别的参考指标；而MMP-2、MMP-9和IL-6的表达在高级别组与低级别组之间有显著性差异， 可以作为胶质瘤肿瘤级别的参考指标。胶质瘤患者脑脊液中MMP-9水平在手术后24小时内明显降低，可能与载瘤状态解除有关，可以作为预测患者临床预后的生化指标。