探讨宫清颗粒对人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡及信号转导的影响,为临床防治药物流产后异常子宫出血(简称药流后出血)提供生物学依据。方法:将120例受试者随机分为宫清药流组、茜芷药流组、单纯药流组及负压吸宫组,各30例,收集各组绒毛及蜕膜组织,观察细胞超微结构变化;TUNEL法检测细胞凋亡率(AR)、荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度([Ca2+] i)、免疫组化法检测蛋白激酶C(PKC)蛋白表达。

　　结果:宫清药流组绒毛、蜕膜组织细胞超微结构出现典型凋亡改变,AR、[Ca2+] i升高, PKC蛋白表达降低,与其它3组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:宫清颗粒能影响细胞内Ca2+及PKC介导的细胞信号转导,诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡,促进绒毛与蜕膜组织完全排出,进而防治药物流产后出血。

　　药物流产具备安全、痛苦小等优点,但存在出血时间长、出血量多等问题,个别病例出血时间长达1～4个月,并有6％～10％的不完全流产率及潜在大出血危险。中药复方宫清颗粒组方是长期应用于临床的有效方剂,已获国家药品监督管理局新药临床研究批件,并顺利完成Ⅱ期临床研究。本研究从细胞凋亡及信号转导角度探讨宫清颗粒防治药物流产后出血的作用机制,为临床应用提供生物学依据,丰富中医学“产后多虚多瘀”理论的科学内涵。

　　资料与方法

　　一、研究对象

　　受试对象120例,均为2006年5月～2007年10月就诊于山东中医药大学附属医院妇科门诊者,根据《中华妇产科学》、《妇产科诊疗常规》、《中药新药临床研究指导原则》有关内容拟定病例纳入与排除标准。按照随机数字表,采取随机分组双盲法,将受试对象分为宫清药物流产组(A组)、茜芷药物流产组(B组)、单纯药物产流组(C组)及负压吸宫流产组(D组),每组各30例。

　　二、药物与试剂

　　米非司酮(国药准字H20000628,批号050501)及米索前列醇(国药准字H10960144,批号050309),均由上海华联制药有限公司生产。宫清颗粒由浙江爱生药业有限公司生产(国家药品监督管理局新药临床研究批件2003L01386)。

　　三、服药方法

　　1.A组　按药物流产常规方法服用米非司酮和米索前列醇。服米非司酮第1d开始服宫清颗粒, 48g/d,分3次服用,连服3d。

　　2.B组　服米非司酮第1d开始服茜芷胶囊(甘肃兰药药业有限公司生产), 15粒/d,分3次服用,连服3d。

　　3.C组　药物流产常规方法服用米非司酮及米索前列醇,不服中药。

　　4.D组　行负压吸宫流产术。

　　四、组织学分析

　　1、取材　收集A、B、C组服药后排出的新鲜绒毛各30例和蜕膜组织各20例,D组手术时取得的绒毛和蜕膜组织各30例,立即用生理盐水冲净,常规固定。

　　2、透射电镜下细胞超微结构观察　环氧树脂(812)包埋,超薄切片机切片,厚度约60nm,醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色。JEM-1200EX透射电镜观察,拍照。

　　3、TUNEL法检测细胞AR　标本切片HE染色后,脱蜡,蛋白酶K室温孵育20min;滴加50μl的TUNEL反应混合液,于湿盒中37℃孵育60min;加入50μl转化剂POD, 37℃孵育30min;经DAB显色、苏木素核复染后脱水、透明、封片。以上各步骤均用PBS冲洗,阴性对照用不含末端脱氧核苷酸转移酶的TUNEL反应液孵育。图像定量分析:TUNEL阳性反应物定位于细胞核,呈棕黄色,着色阳性细胞为凋亡细胞[6]。随机选取10个非重叠视野(×100),阳性细胞所占百分率为AR。

　　4、荧光分光光度计检测[Ca2+] i　日立F-4500型荧光分光光度计设定激发光光栅5nm,发射光光栅10nm,测定温度为37℃。以光谱方式测定Fura-2/AM标准液和负载液的激发光谱,其最大波长由380nm降到340nm,说明Fura-2/AM负载进入细胞内。以时间方式测定(激发波长340nm)Fu-ra-2负载液荧光强度(F值),加入10％TritonX-100,终浓度为0. 1％, 30min后检测最大荧光强度Fmax,加入EDTA,终浓度为5mmol/,l 30min后测得最小荧光强度Fmin。[Ca2+] i(nmol/L)=Kd(F-Fmin/Fmas-F),Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数, 37℃时224nmol/L。

　　5、免疫组化法检测细胞PKC蛋白表达变化　标本切片脱蜡, 3％H O 室温孵育10min;漂洗后微波炉抗原修复; 10％正常山羊血清封闭后加一抗孵育4℃过夜;漂洗后滴加辣根酶标记二抗, 37℃孵育30min; DAB显色剂显色后;自来水充分冲洗,复染,封片。采用Leica QW in V3图像分析软件分析结果,蛋白表达强弱与灰度值大小呈负相关,即蛋白表达越强则灰度值越低。

　　五、统计学方法

　　采用SPSS12.0统计学软件,计量资料结果用均数±标准差( ±s)表示,先采用方差齐性检验,再用组间两两比较q检验、秩和检验进行组间差异的比较,计数资料用x2检验。

　　结　果

　　一、一般情况

　　经统计学分析, 4组观察对象在年龄、生育情况、停经天数及孕囊大小等方面差异无统计学意义,具有可比性。

　　二、绒毛、蜕膜组织细胞超微结构观察(图略)

　　1、D组　合体滋养细胞、蜕膜细胞表面微绒毛丰富,细胞滋养细胞基底膜正常,滋养细胞、蜕膜细胞核形态正常,核内染色质分布均匀,细胞器正常,颗粒细胞内有大量电子密度高的分泌颗粒,细胞间连接紧密。

　　2、C组　合体滋养细胞、蜕膜细胞表面微绒毛脱落,细胞滋养细胞基底膜增厚,滋养细胞与蜕膜细胞核形态不规则,核膜肿胀,出现常染色质团块状,异染色质边集,核固缩等凋亡形态学改变。颗粒细胞内分泌颗粒明显减少,细胞间连接缝隙增宽。

　　3、B组　合体滋养细胞、细胞滋养细胞、蜕膜细胞及颗粒细胞超微结构变化与C组相似。

　　4、A组　出现凋亡形态学改变,程度较C、B组加重,合体滋养细胞、细胞滋养细胞、蜕膜细胞及颗粒细胞均出现典型凋亡小体,其内包含结构基本正常的细胞器。

　　三、AR、[Ca2+] i和PKC的变化

　　A组绒毛滋养细胞及蜕膜组织细胞AR、[Ca2+] i升高,绒毛及蜕膜组织细胞PKC灰度值升高,与其它3组比较差异均有统计学意义(P<0.05),说明A组PKC蛋白表达较其它组降低。

　　表1　绒毛滋养细胞AR、[Ca2+] i和PKC的变化(

　　±s)

　　组别

　　例数

　　AR(％)

　　[Ca2+]i

　　PKC灰度值

　　A组

　　30

　　3.02±0.20*▲▲△

　　125.37±6.40*▲△△

　　135.71±3.82*▲△

　　B组

　　30

　　2.89±0.19*

　　120.33±7.58*

　　133.73±3.81*

　　C组

　　30

　　2.87±0.21*

　　119.91±6.80*

　　133.17±3.70*

　　D组

　　30

　　2.17±0.23

　　109.03±7.84

　　127.51±3.73

　　*与D组比较P<0.01　▲与C组比较P<0.05　△与B组比较P<0.05 　▲△与C组比较P<0.01　△△与B组比较P<0.01

　　表2　蜕膜组织细胞AR、[Ca2+] i和PKC的变化(

　　±s)

　　组别

　　例数

　　AR(％)

　　[Ca2+] i

　　PKC灰度值

　　A组

　　20

　　3.13±0.18*▲△

　　130.65±7.46*▲△

　　142.80±4.93*▲△

　　B组

　　20

　　3.02±0.14*

　　125.14±8.04*

　　139.17±4.94*

　　C组

　　20

　　2.99±0.19*

　　124.42±7.96*

　　138.25±5.18*

　　D组

　　30

　　2.83±0.15

　　110.31±7.53

　　131.45±4.03

　　*与D组比较P<0.01　▲与C组比较P<0.05　△与B组比较P<0.05

　　讨　论

　　近年研究认为药物流产后子宫异常出血与绒毛、蜕膜细胞凋亡不足有关,而米非司酮作用后的绒毛和蜕膜组织细胞表现出凋亡倾向,本研究结果与报道相一致。中药对细胞凋亡具有调节作用已得到证实,活血化瘀药能诱导细胞凋亡,调节细胞增殖与凋亡平衡,清热药、补益药能诱导肿瘤细胞凋亡,但尚未见有关于中药诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡预防药物流产后出血的研究报道。

　　本研究观察4组妇女流产后人早孕绒毛、蜕膜组织细胞超微结构变化,发现宫清颗粒用于药物流产后绒毛、蜕膜组织细胞凋亡程度较其它3组高,且该组绒毛、蜕膜AR明显高于其它组,提示宫清颗粒有诱导药物流产人早孕绒毛、蜕膜细胞凋亡的作用。为进一步探讨宫清颗粒这一作用机制,我们对参与细胞生命活动的关键,第二信使Ca2+及其重要靶分子蛋白PKC进行了研究。

　　Ca2+是各条细胞信号传导途径的枢纽,有证据表明[Ca2+] i升高可引起细胞凋亡。近年来,有关药物流产细胞凋亡的研究逐渐深入,但对参与细胞凋亡信号转导的重要因子Ca2+超载的研究未见报道。我们首次将[Ca2+] i纳入流产药物对细胞凋亡影响的研究,发现宫清颗粒能升高绒毛、蜕膜[Ca2+]i提示宫清颗粒可能通过影响Ca2+介导的信号转导,诱导人早孕绒毛及蜕膜发生细胞凋亡。在信号通路中PKC是细胞内Ca2+作用的重要靶分子蛋白,它在细胞的生长、分化与凋亡中起重要作用。

　　PKC活化后通过对靶蛋白分子的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化而介导多种生物效应,它能使G蛋白的活化因磷酸化而下调,引起环磷酸腺苷(cAMP)水平增高,诱导细胞凋亡。也有报道PKC活化引起细胞内cAMP水平升高,促进转录导致细胞增殖和分化。研究发现米非司酮抑制早孕滋养细胞PKC信号转导通路及raf-1瀑布激酶链和分裂激活蛋白,抑制增生分裂并诱导凋亡。本研究发现宫清颗粒用于药物流产后绒毛滋养细胞、蜕膜组织细胞PKC蛋白表达降低,提示宫清颗可能通过降低PKC蛋白表达,抑制细胞分化增值,诱导凋亡。

　　中医认为药物流产乃人为终止妊娠,药物流产后阴血骤虚,气不摄血;或胎堕不全,余血留滞胞宫,瘀血不去,新血难安;或外邪乘袭酿而化热,热伤血络;或三者相互交错,虚实并存,以致恶露不净。“瘀、虚、热”是本病的主要病机,活血祛瘀是治疗本病的关键,瘀去而血行,养血益气是治疗本病的基础。

　　宫清颗粒君药益母草活血祛瘀,清热止血;臣药马齿苋、生蒲黄、牛膝助君药活血化瘀,凉血止血;佐药当归、党参养血益气,活血化瘀;使药甘草补中益气,调和诸药;实验证实该药能协同米非司酮抗早孕,提高完全流产率,缩短阴道出血时间,减少阴道出血量,不影响卵巢排卵功能及月经恢复;药效学实验表明宫清颗粒能明显兴奋子宫平滑肌,缩短出凝血时间、增加雌激素含量,有抑菌和镇痛作用,并发现该药有诱导绒毛细胞凋亡倾向。

　　通过本研究发现该方能诱导人早孕绒毛、蜕膜组织细胞凋亡,促进绒毛与蜕膜组织完全排出,进而防治药流后出血。对Ca2+和PKC介导的细胞信号转导的调节可能是其作用机制之一。但细胞内Ca2+的来源及其在诱导绒毛、蜕膜组织细胞凋亡中的确切机制尚未明确,此方向的深入研究将进一步揭示本病发病机理及药物防治机制。