一、 引言

　　1997年Asahara首次证实了能分化为ECs的干细胞――EPCs的存在[1]。随后，人们对EPCs的研究越来越广泛，特别是针对EPCs参与肿瘤和缺血等方面的研究，对临床缺血和肿瘤的诊断和治疗产生了深远影响[2],[3],[4],[5],[6]。然而，当前EPCs临床研究和应用面临很多困惑，其中最大难点是血管再生的细胞来源和相关机制。明确EPCs分布及其来源是靶向治疗的前提条件。我们前期工作证明健康肝组织内血管壁含有EPCs。确切证明血管壁存在EPCs，扩大了我们对EPCs来源的认识，可进一步阐明血管新生的机理。

　　值得关注的是，相对于EPCs，来源于血管壁的细胞，如人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells, HAECs)，系分化的成熟ECs。然而，他们均具备高增殖潜能，能培养传代40-60代，这种特性与EPCs相似。基于他们的干细胞特性，有研究者推测来源于血管壁的ECs可能包含EPCs，这些EPCs维系胚胎血管发育和成人血管的更替[7]。2005年Ingram依据‘单个细胞的增殖和克隆形成差异’证实EPCs存在异质性[8]。采用同样的原理‘单个细胞的增殖和克隆形成’证实HUVECs和HAECs存在干细胞样细胞，因而推测HUVECs和HAECs内可能存在EPCs。

　　迄今，尚无直接的证据证实EPCs存在于血管壁及其来源的ECs。血管壁是否存在EPCs?如果存在，位于血管哪一层?内膜层还是外膜层?什么作用?我们采用最易获取脐带组织，基于IHC、real-time PCR、FCM、western blots等手段检测EPCs的表面标记(AC133、KDR和CD34) [9],[10],[11]，认证具有动脉特性的脐静脉血管是否含有EPCs，并探讨以上问题。

　　二、 材料与方法

　　本研究方案经鼓楼医院伦理委员会讨论通过，并符合Helsinki宣言。所有样本的供体均知情并同意。

　　1. 人脐静脉来源细胞的分离

　　本研究收集了20例足月新生儿脐带。人脐静脉(human umbilical veins, HUVs)来源细胞的分离方法参考(Jaffe EA, et al., 1973)[12]。首先脐静脉两端置管，PBS冲洗，灌注0.25％胰酶(Hyclone, Logan, UT)，阻断并置于37˚C孵育7分钟，尔后采用含20％ FBS(Hyclone)的RPMI 1640 (Gibico, NY)灌注，收集细胞悬液，离心，EGM-2 MV Bullet Kit (CC-3202, Clonetics, San Diego)重悬细胞后继续培养。详细步骤参考附件。

　　2. 细胞培养

　　消化的细胞培养于纤维层粘蛋白(Sigma, Louis)包被的25cm2培养瓶中，并置于5％ CO2
和37˚C的培养环境。24小时后换液并舍弃未贴壁的细胞。尔后每3天换液，当细胞集合度达到70-90％时按1:4传代。采用IHC、real-time PCR、FCM、western blots等手段检测1、3、6代EPCs的表面标记。Caco-2细胞株(南京大学生物化学系胡一桥教授惠赠)来源的蛋白或基因作为AC133蛋白或基因的阳性对照。Caco-2细胞株培养于含20％ FBS (Hyclone)的Minimal Essential Medium (MEM, Gibico).

　　3. 脐带准备

　　经胰酶消化前或消化后的脐带被分为三段, 储存于液氮，分别用于IHC、western blots和real-time
PCR检测。用于IHC的样本事先采用OCT冰冻切片包埋剂包埋。

　　4. 免疫组化：详尽步骤参考附录研究方法

　　抗体：AC133、CD34、KDR和CD105抗原的IHC分别采用小鼠抗人AC133的单克隆抗体 (Miltenyi Biotec, German) 、兔抗人CD105多克隆抗体、小鼠抗人CD34或KDR的单克隆抗体(Santa Cruz, CA)。显色二抗为生物素化的山羊抗小鼠和兔的免疫球蛋白(Neomarkers, Fremont, CA)。

　　组织和细胞准备：来源于O.C.T 包埋组织块的4-µm厚连续切片分别用于AC133、CD34、KDR和CD105抗原免疫检测，第一张用于苏木素-伊红染色(HE染色法，详尽步骤参考附录研究方法)。1、3和6代HUVs来源细胞和Caco-2细胞株培养于纤维层粘蛋白包被的载玻片。细胞培养2-4天后，4˚C丙酮固定。

　　免疫反应和显色：适当预处理后，依次孵育一抗(AC133，1:800;KDR, 1:150;CD34，1:400;CD105，1:100)和第二代生物素标记二抗工作液(DAKO, Carpinteria, CA, 1：100)，DAB显色，苏木素衬染。PBS作为阴性对照孵育。15周胚胎组织(来源于我院病理科)和Caco-2细胞株作为AC133抗原的阳性对照样本。

　　计数：HUVs横断面血管壁每毫米的AC133、CD34、KDR或CD105阳性细胞数。在横断面肌层内计数5个随机视野(放大倍数，×200)AC133或KDR阳性细胞平均数。而细胞化学的阳性细胞计数为5个随机视野(×100)阳性细胞平均数。所有切片经课题组两位研究者分别双盲评估。所有图片均在Olympus显微镜下(CX-31)采用Olympus照相机拍摄 (C-5050Z)。

　　5. 流式细胞检测

　　贴壁细胞经0.05％胰酶(Gibico)消化后，重悬于PBS。100µL(约2×105 细胞)悬液(含5％ FCS)经直接荧光标记抗体PE-AC133 (Miltenyi)、PerCP-CD45和FITC-CD34 (B&D, Heidelberg, Germany)、FITC-CD105
(R&D, Minneapolis, MN)和PE-CD146 (Chemicon, CA) 4˚C孵育40分钟。IgG1-FITC 和 IgG2α-PE抗体(B&D) 作为阴性对照。PBS洗涤两次。500µL PBS重悬后上机(Calibur FACS)检测。每个样本收集50000细胞。采用WinMDI软件(BD)分析各种表面标记细胞的百分比。

　　6. Western blots

　　Western blots参考Fauth F, et al., 2001[13]及附录研究方法。在液氮状态下，脐带组织被碾磨成粉状。细胞和组织在裂解前经4˚C PBS洗涤3遍。细胞或组织经等体积RIPA裂解液(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02％ NaN3, 1％ Triton X-100, 1％ SDS)和 1:200蛋白酶抑制剂(Sigma)于冰上裂解，并经超声粉碎4次。裂解30分钟后，收集裂解物，离心，12 000 rpm, 4℃, 10分钟。上清液分装并于-20℃保存。Coomassie (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) 测定蛋白质浓度，尔后依次蛋白变性，上样，电泳(8％ SDS-PAGE gels Amresco, Ohio)，电转膜仪转膜(Roche, IN)(100mA 40分钟)，3％ BSA封闭，依次孵育一抗(小鼠抗人AC133单克隆抗体，1:100, Abcam;兔抗人KDR单克隆抗体，1:1000, Cell Signal Tech;小鼠抗人β-actin单克隆抗体，1:1000, Santa Cruz)和AP标记二抗(山羊抗小鼠或兔单克隆抗体, 1:2000; Santa Cruz)，化学显色(NBT/BCIP试剂盒, 华美生物)。BlueRanger预染蛋白(18.3-215kD, Pierce, Woburn,
MA)作为本试验蛋白标尺。

　　7. Real-time PCR

　　RNA抽提和逆转录：采用经典的酚-氯仿法抽提肝组织RNA;而外周血RNA抽提采用Trizol法 (Life Technologies, Maryland)。尔后采用ExScriptTM逆转录试剂盒(TaKaRa, JP)逆转录最大量RNA。详尽步骤参考附录研究方法。

　　PCR: AC133、CD34、KDR、 CD105和GAPDH基因的引物由上海基康生物公司采用Primer Express
2.0软件(Applied Biosystems, Foster City, CA)设计并合成。引物的基本信息总结于表。采用探针法(TaqManTM, Molecular Beacon等)按如下体系和反应条件在Stratagene Mx3005P行RT-PCR：20-μL反应体系包括2-µL cDNA模版、900 nM上下游引物、250 nM探针、5 mM Mg2+ 、0.1 U/µL Ex Taq HS (ExScriptTM real-time PCR Kit, TaKaRa);反应条件为95°C 20秒 1个循环，95°C 5秒和60°C 20秒共55个循环。每个样本每个基因重复3次。