恶性实体瘤患者自体CIK细胞的体外扩增及初步临床应用

　  李岩，梁婧，刘晓琳，俞新爽，刘海荣，曹莉莉

【摘要】目的 观察恶性实体瘤患者外周血来源的细胞因子诱导杀伤细胞(CIK) 在自体血浆中的增殖特性,回输治疗的安全性及近期疗效。方法 用淋巴细胞分离液分离获取40例恶性实体瘤患者外周血单个核细胞,无血清培养基中添加rh IFN-γ、Anti-CD3mAb和rh IL-2联合诱导单个核细胞为CIK细胞。在培养第13天进行细胞计数,通过流式细胞术检测细胞免疫表型,并将细胞进行自体回输。结果 40例恶性实体瘤患者回输自体CIK细胞后,PR 6例, MR 13例,SD 9例,PD 12例,治疗总有效率为45%，临床获益率67.5%。多数患者一般情况明显改善；治疗后T细胞亚群中CD3+、CD4+细胞及CD4+/CD8+比值及NK细胞计数较治疗前显著升高。治疗过程中出现8例低热,2例高热，未观察到其它明显的毒副作用。结论 恶性实体瘤患者自体血浆扩增CIK细胞,回输治疗安全有效,且无明显的毒副作用。山东省千佛山医院肿瘤化疗科梁婧

【关键词】细胞因子诱导的杀伤细胞；免疫治疗；恶性肿瘤

近年对恶性肿瘤的综合治疗方案在临床上已得到广泛认同。其中,细胞过继免疫治疗是将具有强大杀瘤活性的免疫细胞在体外扩增后回输给患者的治疗方法，已成为继手术、放疗、化疗后对肿瘤患者进行综合治疗的重要手段之一。CIK细胞是在体外应用多种细胞因子和CD3mAb刺激诱导恶性肿瘤患者外周血单个核细胞而获取的异质细胞群，兼有T 细胞强大的杀瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制的杀瘤特点, 故又称为NKT样细胞。本研究通过在体外扩增40例恶性实体瘤患者外周血来源的CIK 细胞,，并进行自体回输，探索恶性实体瘤患者自体CIK细胞临床应用的安全性及近期疗效，为自体CIK细胞过继免疫治疗在临床的推广应用积累一些有益经验。

1 　材料与方法

1. 1 　临床资料

40例均为山东省千佛山医院2007年1月至2008年12月住院的恶性实体瘤患者，所有病例均经病理或细胞学检查确诊，分期Ⅱ～Ⅳ期。其中,男性22例,女性18例,年龄为34～74岁。大肠癌8例,乳腺癌8例, 肺癌6例，肝癌6 例,胃癌4例,肾透明细胞癌3例,口腔鳞癌2例,前列腺癌2例,卵巢癌1例。Kamofsky评分>60分，预计生存期大于3个月，治疗前心、肝、肾功能及血常规大致正常。末次化疗时间距本次治疗间隔1月以上，并排除心、肺、肝、肾功能不全者及对生物制品敏感者。所有患者或家属均已签署DC-CIK细胞治疗知情同意书，并报医院伦理委员会批准。并接受DC-CIK细胞治疗。于2008年2月至2008年12月接受自体CIK细胞治疗共1疗程。

1. 2 　主要材料

GT-T551无血清培养基（日本TAKARA BIO公司），鼠抗人抗CD3 单抗（古巴C12MABS.A公司），DMEM培养基、Ficoll液、HEPES液及PBS缓冲液（均为美国SIGMA公司），基因重组人干扰素γ( IFN-γ) （上海生物制品所），重组人白细胞介素2 ( IL-2)（山东泉港药业有限公司），重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 和IL-4（购自厦门特保生物工程股份公司），本研究使用的双色荧光抗体均是FITC和PE标记的鼠抗人单克隆抗体，包括CD3、CD4、、CD8、CD56、CD80等（晶美生物工程有限公司）。流式细胞仪FACS Calibur（美国BD公司），CO2恒温培养箱（日本SANYO公司），正置及倒置显微镜（日本Olympus公司）,体细胞治疗实验室为GMP实验室，细胞培养操作在百级超净工作台进行。

1. 3 　CIK 细胞的培养

1.3.1细胞分离

无菌条件下采集的正常人抗凝外周全血经淋巴细胞分离液梯度离心获取单个核细胞（PBMC）,再用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离后经Hank’s液洗涤3次，收集纯度在90%以上的PBMC。

1.3.2 CIK细胞体外培养和扩增

PBMC经Hank’s液洗涤3次，用GT-T551无血清培养基配成完全培养基，调整细胞浓度1×106/ml，加至25cm3细胞培养瓶内，置37°C、5%CO2培养箱中培养2h，吸出上清液及非粘附细胞另置75cm3细胞培养瓶内，加入无血清培养基。第一天加入rh-干扰素r1000U/ml，第二天加入抗CD3单抗50ug/ml，IL-1a100U/ml，IL-21000U/ml，连续培养3d，更换含有上述因子的培养液1次，连续培养14天。

1.3.3细胞回输

   收集第14～16d的DC-CIK细胞，细胞总数大于1×1010个，洗涤3次后，行细菌学、支原体及内毒素等检测无异常，将细胞溶于生理盐水250ml，静脉滴注，2小时内回输患者体内。同时，自回输前1天开始连续给予IL-2 100万U/天，肌注，1次/天，共5天。

1.4 临床疗效指标观测

  ⑴患者一般情况、生活质量的改善KPS评分；

⑵T细胞亚群和NK细胞计数检测：在DC-CIK细胞回输前及回输后1月进行T细胞亚群和NK细胞计数测定，用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶标注（APAAP）测定；

⑶肿瘤标记物如CEA、CA125、AFP等检测；

⑷影像学指标：治疗前及治疗后1个月行胸、腹及盆部CT或PETCT（正电子发射计算机断层显像仪）检查复查对比评价疗效；

⑸血常规、生化等常规检查及不良反应随时观察检测。

1.5 疗效评定

按WHO实体瘤的近期疗效标准分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）、进展（PD）4级。生活质量变化：记录患者症状和体征变化，用Kamofsky计分法判断治疗前及治疗后的变化，凡在治疗后疗程开始前计分提高10分或10分以上者为改善，二下降10分或10分以上者为恶化，提高或下降10分者为稳定。总提高率为改善+稳定。治疗结束1月进行疗效评价。

1.6 统计学处理

实验数据用SPSS 11.0 统计软件分析。计量资料以. ±s 表示，采用t或F 检验。率的比较采用χ2 检验, P < 0.05 为差异有显著性。

2 　结  果

2. 1 CIK 细胞的增殖情况

CIK细胞在10 %自体血浆中得到大量扩增。在倒置显微镜下，CIK细胞形态似外周血淋巴细胞，但体积稍大。在培养第1～3天，细胞数量有所减少。从第4～5 天细胞开始增殖，可观察到细胞体积增大，胞质少、胞核大、圆。有时可观察到细胞分离相和集落样细胞团。在培养第7天，细胞数量明显增多，细胞团更大，悬浮在培养液中(图1)。在培养第13天，CIK细胞数量可达到原始细胞数的(30.0±5.2)倍。

2. 2 　疗效观察

⑴40例恶性实体瘤患者自体CIK细胞治疗1疗程后,CR 0例，PR 6例，MR 12例，SD 9例，PD 13例。治疗有效率（CR+PR+MR）为45%，临床获益率（CR+PR+MR+SD）为67.5%，见表1。⑵40例患者的一般情况除3例未见明显变化外，其余37例均有不同程度好转，其中23例（57.5%）出现食欲和体力改善，17例（42.5%）出现睡眠改善，11例（27.5%）出现癌性疼痛减轻，7例（17.5%）出现体重增加。见表1

表1 　CIK 细胞治疗40 例恶性实体瘤的疗效观察

临床诊断

例数

CR

PR

MR

SD

PD

大肠癌

乳腺癌

肺癌

肝癌

胃癌

肾癌

口腔鳞癌

前列腺癌

卵巢癌

8

8

6

6

4

3

3

2

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

2

1

0

0

1

1

0

0

2

3

2

2

2

1

0

1

0

2

0

2

0

2

1

1

1

0

3

3

1

4

0

0

0

0

1

2. 3  治疗前后免疫指标的变化

     经CIK细胞治疗1个疗程后1月，患者T细胞亚群中CD8+下降（P＜0.05），CD3+、CD4+细胞及CD4+/CD8+比值及NK细胞计数较治疗前显著升高。见表2。

表2 CIK细胞治疗前后恶性肿瘤患者免疫指标变化（n=40, ±s）

项  目

治疗前

治疗后

P

CD3+

CD4+

CD8+

CD4+/CD8+

NK

59.82±7.34

28.24±5.63

30.37±8.83

0.94±0.53

13.47±4.22

67.42±8.86

38.31±6.01

26.46±7.55

1.75±0.62

18.39±3.10

<0.01

<0.01

<0.05

<0.01

<0.05

2. 4 　CIK 细胞回输的安全性及不良反应

在CIK 细胞回输治疗期间，观察到的不良反应主要是畏寒、发热。有8 例患者体温在37.0℃～37.9℃；有2例患者体温在38.0℃～38.9℃。常出现在回输细胞后2～6h 。持续3～5 h 后,多数患者不经处理可自行缓解，少数患者给予解热镇痛药退热。另外，有少数患者出现乏力、肌肉酸痛等类感冒症状。未观察到低血压、过敏及肺水肿等严重毒副反应。治疗前后肝、肾功能检测均无明显改变。所有患者均未出现移植物抗宿主反应性疾病。

3 　讨 论

肿瘤的生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗肿瘤的模式，过继细胞免疫治疗作为最有效的免疫治疗措施之一，通过给患者提供现成的免疫力达到抑制和杀伤癌细胞，清除手术、化疗、放疗后微小残留病灶及提高患者生存质量，已成为目前治疗恶性肿瘤的重要辅助治疗方法。

国内外的研究证实CIK细胞是一类体外增殖能力强、杀瘤活性高,对多重耐药肿瘤细胞敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞。我们观察到40例恶性实体瘤患者回输自体CIK细胞后，6 例部分缓解；13例好转；9例病情稳定；12例进展。治疗总有效率为45%，临床获益率67.5%。在治疗过程中有8例病人出现畏寒、低热，2例高热，少数患者有乏力、肌肉酸痛等类感冒症状，未观察到其它明显的毒副作用。这可能与回输的CIK 细胞在体内继续分泌IL-2、IFN-γ、IL-6、GM-CSF、TNF等多种具有抗肿瘤效应的细胞因子有关。

CIK 细胞是一类以CD3+CD16+CD56+为主的异质细胞群。国内外的研究表明，细胞因子IFN-γ、IL-1 、Anti-CD3mAb、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15等的不同组合可诱导单个核细胞为CIK细胞[10]。本研究在含10 %自体血浆的RPMI-1640 完全培养基中添加rh IFN-γ、rh IL-2 和Anti-CD3mAb 联合诱导恶性实体瘤患者外周血来源的单个核细胞生成CIK细胞。在健康状况下,外周血CIK 细胞大约为1%～5%。而我们的结果提示，在培养第13 天，CIK 细胞数量增加(30.0±5.2) 倍。CD3+和CD3+CD16+CD56+分别扩增到(93.0±6.1)%和到(25.8±12.2)% ,构成CIK细胞发挥强大杀瘤效应的基础。在研究中发现CIK细胞的数量和纯度在个体间的差异较大，可能与外周血原始T 细胞的数量及机体免疫抑制状态有关。患者经治疗后临床症状如倦怠乏力、失眠、食欲不振等均有十分明显的改善，采用Karnofsky 评定法和治疗前后体重的改变两项指标评估了患者的生存质量,治疗后Karnfsky评分平均提高15分左右,体重较前增加1.5kg。表明，经系统综合治疗后患者生存质量有了明显好转。自体CIK细胞治疗可以明显提高CD3 T细胞和NK细胞的比例( P < 0. 01) ,缓解CD4/CD8的免疫倒置(P < 0.01)，增强患者的细胞免疫功能，这对于经常规治疗后免疫功能极其低下的肿瘤患者来说具有重要意义。明经CIK细胞治疗,大多数患者的生活质量明显改善。目前这这些患者病情稳定，但自体CIK治疗的远期疗效及其对患者生存期的影响，仍需长期连续随访.

附：典型病例

患者，男，90岁，因反复咳嗽、喘息20年，多次收住我院保健科。 2006年6月CT发现肺癌（右肺后段肺癌，肺门淋巴结转移），采取体细胞治疗6次， 2008年8月份复查CT，肺内肿块明显的缩小（80%）。2008年12月复查发现肺内占位消失,纵隔占位明显的缩小。

【参考文献】

[1] HOFFMANT DM, GITLITZ BJ, BELLDEGRUN A,et al. Adoptive cellular therapy[J]. Semin Oncol,2000,27(2):221-233.

[2] 秦福丽.CIK细胞的特点及临床应用.国外医学肿瘤学分册,2004,31(11):824-826.

[3] 乔晓娟.CIK细胞抗肿瘤的研究进展.医学综述杂志,2004,12(10):711-713.

[4] LINN YC,LAU LC, HUI KM.Generation of cytokine-induced killer cells from leukaemic samples with in vitro cytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blasts[J].Br J Haematol,2002,116(1):78-86.

[5]MARTEN A, RENOTH S, VON LILIENFELDTOAL M,et al.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after coculture with idiotype-pulsed dendritic cells[J]. Haematologica,2001,86(10):1029-1037.

[6]隋承光,孟凡东,王晓华，等.CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究。中国医科大学学报，2005，34(3):210-211.

[7]张有顺, 黄　玲, 杨红玲,等. 肝癌患者CIK细胞的诱导及对肝癌细胞毒作用的研究.上海免疫学杂志，2003，23(3):201-209.