蛋白质组(Proteome)和蛋白质组学(Proteomics)是在人类基因组计划研究发展的基础上形成的一个崭新概念，在本世纪生命科学的前沿研究中占有举足轻重的地位。经过近十年突飞猛进的发展，蛋白质组学在生命科学的各个领域都取得了一定的成就，其研究方法及技术也得到了完善和提高。

　　一、蛋白质组和蛋白质组学概况

　　1、蛋白质组概念

　　人类基因组计划成后，生命科学的重心随之转向“后基因组时代”，即由结构基因组学转向更加广泛的功能基因组学，蛋白质组学即是其最重要的组成部分。蛋白质组的概念由澳大利亚学者Williams[]提出，距今仅十余年时间，即“一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质”，其研究方法的特点是采用高分辨率的蛋白质分离手段，结合高效率的蛋白质鉴定技术，全景式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱。随着人类对这个领域认识的不断深入，这一概念仍在不断完善。

　　蛋白质组的提出建立在基因组图谱被确定的基础上，是基因组的逻辑延续和发展，担不是单纯的顺延。基因转录的mRNA 可能按照不同组合方式来拼接，并且许多蛋白质还要经过翻译后的磷酸化和糖基化修饰，所以1个基因可能产生多于1个的蛋白质。1个基因组可能产生的蛋白质总数是根据所有开放阅读框的数字推测的。人类基因组图谱初步分析结果表明，人类基因总数只有大约3万多到4.5万个基因，故粗略估计人类蛋白质可达30万种以上，研究人类全部蛋白质图谱的蛋白质组学即 “完全”蛋白质组学就是以研究人类所有蛋白质，建立人类蛋白质图谱为目的。

　　从功能基因组学的角度，认为每种疾病平均与10个左右基因相关，而每种基因又可能与3-10种蛋白质相关，故推断如果以人类主要的100-150种疾病进行计算，就应该有3 000-15 000种主要的疾病相关蛋白质[]，理论上，掌握这些疾病相关的蛋白质就可以掌握人类疾病的病理过程，但事实并非如此，和稳定的基因组不同，蛋白质组存在着时间上的特殊性和空间上的多样性，即在同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期，其蛋白质组也是在不断的变化的。从这种意义上说，精确的描述细胞内存在的全部蛋白质的状态及相关的蛋白质组学是不可能实现的。所以目前，蛋白质组学的研究主要集中在通过对蛋白质丰度、性质的考察来揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白，使之成为药物筛选的靶点，指导基因组的分析，即差异蛋白质组学。差异蛋白质组学着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，故具有明确的研究目的和广泛的应用前景。

　　2、蛋白质组学研究方法的技术构成概况

　　1、技术平台和流程简介

　　蛋白质组学研究目的的实现依赖于双向电泳技术的的完善、质谱技术特别是软电离技术的发展、以及因国际性协作促成的生物信息学的建立。蛋白质组学本身的复杂性决定了其研究方法的综合多样性，其中双向凝胶电泳技术(2-DE)联合生物质谱(MS)和液相色谱(LC)联合生物质谱是研究蛋白质最可靠的技术平台，目前已完成的大部分蛋白质组研究都采取了这两种基本方法[]。随着科技的不断发展，现在还出现了四级杆的MALDI-Q-TOF-MS(Q代表四级杆)平台、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICRMS)技术、毛细管高效液相色谱(HPLC)和微/纳喷雾MS等新技术[]，使蛋白子组分析方法逐渐走向标准化和自动化。

　　蛋白质组研究方法的经典流程是：蛋白提取定量-双向电泳-图像分析-质谱分析-信息查询[]。各种实验技术的有缺点不同，根据研究对象和目的不同，可将不同的试验方法结合，使其更有效的分析初样本的蛋白质组，并且标本的收集、处理、蛋白质的提取、电泳的方式、条件、染色方法的选择等都逐渐形成了相对成熟的理论，的并随着科技发展，在不断的试验实践中修改和完善。

　　目前对疾病的蛋白质组研究大部分为差异性蛋白质的探讨，而蛋白质在不同生理、病理条件下的功能各异，部分蛋白质在各个生理病理阶段的存在方式不同，更有一些蛋白质只是短暂的存在于某一时期，这些特点对蛋白质样品的收集时机、处理方式等提出了较高的要求。

　　2、生物信息学

　　生物信息学在蛋白质组学研究中的作用是建立蛋白质数据库并提供搜索平台，它建立在国际化合作的基础上。蛋白质组数据库储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息,相应的软件可分析双向凝胶电泳和质谱得到的数据,以识别蛋白质并描述其基本理化性质,预测潜在的翻译后调节方式和三维结构，这些数据随着研究的深入不断更新。目前最常用的数据库有NCBInr 和Swiss2 Prot 。前者更新快,数据量大; 后者数据量较小,但是信息更为全面。

　　二、玻璃体视网膜疾病的蛋白质组研究

　　眼后段结构，无论是正常的生理结构或者是在病理过程中变化、增生的结构，都普遍存在标本量小、标本难于获得、培养细胞传代困难等特点，这种特点使具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优势的蛋白质组学研究方法在眼部研究方面的应用成为热点。十余年来，国内外眼蛋白组学研究相继开展，初步建立了眼部各个结构的蛋白质数据库并在探讨眼的生理、病理过程方面取得了一定的成绩，近年随着玻璃体切割手术的成熟和完善，对于人类眼底疾病的研究也更加深入，此处仅对与玻璃体视网膜疾病相关的差异蛋白质研究做一综述。

　　1、RPE细胞

　　2003年，Karen A.等人[]收集人RPE细胞并采取多级分离方法制备成亚细胞标本，用 2-DE以及MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS对全细胞、细胞溶质、溶酶体等的蛋白质成分进行分离鉴定，结果确定了278种不同蛋白质。其中1-DE分离出180种蛋白质，2-DE分离出160种蛋白质，两种电泳结果中有63种蛋白质是一致的，所以1-DE和2-DE是互补的蛋白质分离方法。200余种蛋白质中大部分是结构蛋白类的管家蛋白，还有一些具有特殊功能的蛋白质，如视黄醛结合蛋白、视黄醇结合蛋白、光间受体视黄类物质结合蛋白(IRBP)等，这是第一次对人RPE细胞蛋白质进行描述。

　　2004年，Bonilha[]等人应用2-DE和LC-MS/MS方法进一步分离健康小鼠RPE细胞顶部微绒毛的蛋白质，并联合免疫组化方法，确定并部分定位了283种蛋白质，除了许多已经在其他上皮细胞中发现的功能蛋白质外，还发现了一些只存在于RPE细胞顶部并可能担负特殊功能的蛋白质，如Lumican，一种SRLP(小的富含亮氨酸蛋白聚糖)基因家族成员，就第一次在RPE微绒毛中被发现。Lumican在角膜中的作用是使角膜基质中近200层的胶原纤维呈高度规则的格子状排列，从而保持角膜的透明性，故在维持角膜正常生理功能中起到重要作用，但之前并没有在视网膜发现这种蛋白多糖成分。根据最近报道，观察到Lumican基因敲除鼠出现多发的视网膜脱离，结合此项研究在RPE细胞顶部微绒毛标本中分离鉴定出Lumican，推测Lumican可能与视网膜神经上皮层和RPE层贴附的稳定性有关。另外，在RPE细胞顶部微绒毛、基底部向内皱折处、感光细胞外节中发现Neuroglycan C――一种广泛存在与中枢神经系统的跨膜硫酸软骨素蛋白聚糖――因此认为Neuroglycan C是RPE细胞、光感受器细胞外基质共有的一种成分。

　　2、AMD

　　玻璃膜疣(Drusen)是位于RPE和Bruch’s膜之间的一种异常细胞外沉积物，是AMD发展的危险因素。Crabb[]等用LC-MS/MS分离并分析了微克级的人Bruch’s 膜和玻璃疣蛋白成份，检出129 种蛋白质。结果显示，正常眼周边部视网膜玻璃疣样物质中,最常见的蛋白质为基质金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3)、丛集蛋白(clusterin)、玻璃体结合蛋白(vitronectin)和血清白蛋白,而在AMD 眼的玻璃疣中,晶体蛋白则更常见。同时，在AMD眼,存在更多的蛋白质氧化修饰现象,其中一种是TIMP-3 、玻璃体结合蛋白和羧乙基化的吡咯蛋白螯合物明显的共价交联。

　　羧乙基化的吡咯蛋白螯合物是由Bruch 膜中含二十二碳六烯酸盐的脂质氧化而来,AMD 患者的Bruch 膜及玻璃疣内该蛋白含量较正常人明显增高,推测可能是随年龄增长,视网膜抗氧化损伤的自身防御机制减弱,多种蛋白在氧化作用的刺激下,与Bruch 膜中的脂质成分交联、结合并难于正常分离、代谢而逐渐形成沉淀。另一种是糖基化终末产物在玻璃疣中的堆积,可能直接刺激血管内皮生长因子(VEGF) 产生并促进脉络膜新生血管的生成。这些结果进一步支持了AMD 的发病过程中氧化损伤占据重要地位这一假说,同时也提示蛋白质的氧化修饰在玻璃疣的形成中起到重要作用。

　　蛋白质的氧化修饰现象还存在于沉积在RPE细胞内的脂褐素，2003年，Scbutt等人[]对RPE细胞内的脂褐素颗粒(LF)用2-DE和Western蛋白印迹进行蛋白质分析，选出存在脂质过氧化或葡萄糖过氧化损伤的蛋白质，结果显示多种LF相关蛋白因为变异性共价修饰而发生损伤，且许多蛋白质都存在2到3种不同的修饰类型。这种复杂的氧化修饰现象的存在提示LF的多种氧化产物形成的复合体可能参与了多种视网膜疾病如AMD和Stargardt病的细胞毒性病理过程。Thulin[]等人在2005年对脂褐素进行了类似的研究，和Scbutt等人的研究结果类似，观察到广泛的氧化修饰现象，并进一步应用MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS将电泳分离的蛋白质进行鉴定，在脂褐素颗粒中确定了41种蛋白质，并且新发现了疏水蛋白和几种与光感受细胞功能相关的蛋白质，如视紫红质等，并推测可能是因为氧化损伤导致的蛋白质修饰使这些被吞噬的蛋白质不能被消化降解，从而引起RPE细胞中LF的聚积。

　　3、PDR

　　早在1994 年，Bresgen 等[]便开始用2-DE 分析对比增生性糖尿病视网膜病变(PDR) 患者与正常人玻璃体蛋白成分和血清蛋白成分的不同。研究显示，正常的玻璃体内最常见的蛋白质为白蛋白、转铁蛋白、a1-抗胰蛋白酶、IgG和前清蛋白, 而PDR 玻璃体中,转铁蛋白、a1-抗胰蛋白酶和前清蛋白的含量下降,IgG水平升高,更类似于血清蛋白的组成,这些数据证明PDR时发生了血视网膜屏障的破坏。另外,在PDR 玻璃体蛋白质中,还发现3 种在正常玻璃体和血清中未发现的低分子量蛋白,推测可能是病理状态下局部异常蛋白质的额外合成,并可能与玻璃体视网膜的增生反应有关。

　　蛋白质组研究方法提出后，2002 年日本学者Nakanishi 等[]用2-DE和MS分析比较DR和黄斑裂孔患者玻璃体内可溶性蛋白质成分的不同。两种病变的玻璃体内共检测出52 种不同的蛋白,其中35 种是未知蛋白。DR患者玻璃体内的免疫球蛋白Ig、a1-抗胰蛋白酶、a2-硫酸肝素糖蛋白和补体C4蛋白电泳条带明显深于黄斑裂孔者。有趣的是，色素上皮源性因子(PEGF)这种有力的新生血管抑制剂在DR 者的玻璃体内检出。在伴有增生性新生血管的DR 患者玻璃体腔内,出现这种新生血管抑制因子,是否是玻璃体腔内微环境的平衡被打破后一种自身的代偿和恢复机制尚不肯定。而能否将其作为对增生性DR 治疗的一个靶点,也尚待进一步对DR 患者各种眼内蛋白含量和功能变化的研究。

　　随即Ken Yamane等[]在2003年分别将黄斑裂孔和DR患者的玻璃体与各自相对应的血清蛋白进行分析比较，结果在DR患者玻璃体标本中发现烯醇化酶和过氧化氢酶，而这两种酶在DR患者的血清中以及黄斑裂孔患者的玻璃体标本中均为阴性，说明DR患者玻璃体中新出现的这些蛋白质是在眼内产生，并且是与疾病相关的差异蛋白质，但其具体作用仍有代进一步研究。

　　Motohiro Kamei等[]在2005年进而又对糖尿病引起的黄斑水肿(DME)进行了分析，将PDR前期的患眼分为存在DME组和无DME组，对其玻璃体进行蛋白质分析，结果在DME组发现了甲状腺激素受体相关蛋白(Trip-11)和维生素D结合蛋白，这两种蛋白在非DME组是阴性，另外与之前的研究类似的，发现DME组的PEGF水平升高并显著高于非DME组，提示玻璃体中PEGF水平的升高可能和DR的发展程度相关，由于试验设计已经排除了DR在两组间的干扰，所以推测发生DR时PEGF可能有阻止视网膜水肿的作用。

　　4、PVR

　　Alge等[]用2-DE联合MS比较了自然分化的RPE细胞和培养的去分化RPE细胞，检出179个蛋白位点。研究显示，在培养的去分化RPE细胞中，一些参与RPE吞噬作用的蛋白，包括组织蛋白酶D(cathepsin D)和网格蛋白仍然存在，但与细胞形状、细胞粘附和细胞骨架形成相关的蛋白如细胞角蛋白19、肌动蛋白和原肌凝蛋白等表达上调，与细胞增殖有关的蛋白翻译起始因子(elF)-4AI、elF-5A及钙依赖蛋白(annexin) I、II表达也有所上调(这2种蛋白在许多人类肿瘤中呈高表达)，而与RPE细胞功能高度相关的蛋白质如细胞视黄醛连接蛋白(CRALBP)、细胞视黄醇结合蛋白(CRBP)等缺如。说明RPE在体外去分化导致了与RPE细胞专职功能高度相关的蛋白质表达下调，并诱导细胞骨架构建、细胞形态、迁徙、增值、信号传导等相关的蛋白质表达上调，推测RPE细胞的去分化可能触发PVR，为进一步研究PVR的病理过程提供了线索。

　　三、问题与展望

　　近年随着蛋白质组学的迅速发展，蛋白质组研究方法也开始成为眼底疾病研究中的有力武器，但目前的玻璃体、视网膜疾病蛋白质组研究仍比较分散，缺乏对某一类疾病大规模的深入研究。未来的眼底疾病研究应将标本的获得和处理、疾病各阶段的纵向研究、各疾病之间的横向对比、寻找药物信靶点作为重点。就蛋白质组学本身而言，其研究前景是广阔的，但存在很多问题亟待解决，其发展和完善需要不懈的努力。