人类染色体的基础知识

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染色体一词在1888年由Waldeyer提出，对于人类染色体的研究经历了相当漫长的时期。1956年蒋有兴(Tjio)和Levan正确地确定了人体细胞染色体数为46条，之后才真正开始了对人类染色体进行科学而系统地研究，形成了人类细胞遗传学。很快地染色体分析技术应用于临床以探索染色体与疾病的关系。1959年Lejune发现先天愚型为21三体所致，继之又发现Turner综合征和Klinefelter。综合征患者为性染色体异常所致，并逐渐形成了一门新的分支学科――临床细胞遗传学。20世纪70年代始，多种染色体显带技术的发展，提高了染色体分析的精确度。至今已被正式命名的染色体异常综合征有100多种，发现各种染色体异常约10
000种。20世纪80年代中期荧光原位杂交、显微切割技术及染色体涂染等新技术可直接检测染色体及问期核上DNA片段的改变，使细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来，并结合形成新的领域――分子细胞遗传学。

　　第一节 人类染色体

　　一、人类染色体的特征和类型

　　染色体的形态结构特征在细胞周期中以细胞分裂中期最为典型，称为中期染色体。每一个中期染色体均由两条染色单体构成，每一条染色单体由一个DNA分子螺旋而成，两条染色单体互称为姐妹染色单体。两条染色单体通过一个着丝粒彼此相连，此处相对解旋，浅染并内缢，称主缢痕。着丝粒区有一特殊结构为纺锤丝附着位点，在细胞分裂时与染色体移动有关。着丝粒将染色体横向分为两臂，较长的称为长臂(q)，较短的称为短臂(p)。两臂末端各有一特化部分称端粒，为高度重复的DNA序列，端粒是染色体稳定的必要条件。每一条染色体均需有一个着丝粒和两个端粒才能稳定存在。若端粒缺失，则染色体末端将失去其稳定性，发生染色体间非正常连接，形成畸变染色体;若着丝粒缺失，则在细胞分裂时，染色体不能和纺锤丝相连而导致染色体缺失。在某些染色体臂上也可见到浅染内缢的区段称副缢痕。人类近端着丝粒染色体短臂的远侧有一以细丝样结构相连的染色体节称随体，随体与短臂间的细丝样结构称随体柄，实际上也属于副缢痕区，此处是核糖体RNA(rRNA)基因存在的部位。其表达产物与构成核仁及维持核仁结构和形态相关，又称为核仁组织者(NOR)。一般将随体分为两种，凡随体直径小于染色体臂直径1/2的称为小随体，而直径大于1/2的则称为大随体。在群体中，存在着副缢痕的长短、随体大小和数目的多态性，且按孟德尔方式遗传。

　　染色体上着丝粒的位置是恒定的。将染色体沿纵轴分为八等分，根据着丝粒的位置，人类染色体可分为三类：①近中着丝粒染色体，着丝粒位于或靠近染色体中央(1/2～5/8)，染色体长、短臂相近;②亚中着丝粒染色体，着丝粒略偏向一端(5/8～7/8)，将染色体分为长短明显不同的两个臂;③近端着丝粒染色体，着丝粒靠近一端(7/8～末端)(图6-1、6-2)。

　　二、人类的正常核型

　　(一)Denver体制
自1956年Tjio和Leven确证了人类体细胞正常染色体数目是46条，1959年首次发现了先天愚型(Down综合征)是由于比正常人多了一条21号染色体后，世界各地都逐渐将人类染色体的研究应用于临床，发现与报道的染色体病种不断增多。为了便于对病例中畸变染色体的描述和利于国际间的交流，1960年，在美国丹佛(Denver)市召开了第一届国际细胞遗传学会议，讨论并确定了细胞内染色体组成的描述体制――Denver体制，作为识别和分析人类染色体的依据。根据Denver体制，将人类体细胞的46条染色体，分为23对，其中l～22对为男女所共有，称常染色体，依次编为1～22号;另外一对与性别有关，称性染色体。在组成上男、女不同，女性两条性染色体为XX染色体，男性则一条为X染色体，另一条为Y染色体。

　　一个体细胞的全部染色体所构成的图像称核型(karyotype)。将待测细胞的全部染色体按照Denver体制经配对、排列，进行识别和判定的分析过程称核型分析(karyotype
analysis)。

　　(二)非显带染色体核型的识别根据Denver体制，一个体细胞的23对染色体根据大小和形态特征分为7个组(A～G)。染色体分组情况及其各组染色体形态特征见表(6-1)。

　　核型分析通常是将显微摄影得到的染色体照片经识别、分析按分组要求剪贴的过程。根据国际体制的规定，正常核型的描述包括染色体的总数及性染色体的组成，其书写方式为：

　　正常男性核型 46，XY

　　正常女性核型 46，XX

　　(三)染色体显带与显带染色体的命名

　　1、染色体显带技术
在单纯用吉姆萨染料染色的常规制片染色体标本上，只能根据染色体大小和着丝粒的位置粗略估计识别，多数染色体不能准确辨认，尤其是染色体微小改变所致结构畸变的研究受到很大限制。1968年，瑞典细胞化学家Caspersson用荧光染料喹吖因(QM)处理标本后，在荧光显微镜下发现每条染色体沿其长轴都显示出宽窄和明暗不同的横纹――带(band)，且人类的24种染色体所显示的带纹都各具特点(带型)，每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至微小的染色体结构异常也可被检出。
因此，创立了染色体Q显带技术，此技术显示的带纹即称Q带。染色体之所以能显示出带纹，一般认为是构成染色体的DNA分子在不同部位碱基成分及螺旋缠绕程度不同所致。自Q带技术建立不久，又有G带、R带、

　　C带和T带等多种显带技术。

　　常用的显带技术：

　　Q带染色体标本经喹吖因(QM)等荧光染料处理后所显示的带。在染色体臂上显示各具特征的明暗相间的带纹，需在荧光显微镜下观察。Q带特征明显，显带效果稳定，但荧光持续时间短，标本不能长期保存，必须立即观察。

　　G带为目前使用最广泛的一种带型。操作简单，带纹清晰，标本可长期保存，重复性好。其方法是：将染色体经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理，再用吉姆萨染料染色，显示出的深、浅交替的带纹，称G带。其中最常用的是胰蛋白酶处理法。各号染色体所显示出的带型与Q带带型基本相似。其中G带中的深带相当于Q带的亮带，浅带则相当于暗带。

　　R带染色体标本经热磷酸缓冲液处理，再用吉姆萨染色后所显示的深浅交替的带纹称R带。因其恰好与G带着色深浅相反，故又称反带。经G带和Q带显带的染色体，其两臂末端均为浅带，如发生末端缺失、重排等结构异常则难以发现;而R显带的染色体末端则为深带，如果该部位出现异常则易于识别，所以R显带主要用于研究染色体末端缺失和结构重排。

　　C带染色体标本经NaOH或Ba(OH)2等碱性溶液处理后，再将染色体标本放入柠檬酸钠和氯化钠溶液中处理，然后用吉姆萨染料染色，可见每一条染色体的着丝粒区被特异性着色，故称着丝粒带，也称C带。

　　严格地说，C带所显示的是紧邻着丝粒的结构异染色质区，即人类1、9、16号染色体近着丝粒处的副缢痕。而Y染色体的长臂末端为异染色质区，也呈现出明显深染。因此，C带技术用于研究着丝粒区、Y染色体及副缢痕区的结构变化。

　　N带用AgNO3处理染色体标本，可使人类细胞中5对近端着丝粒染色体(13、14、15、2l、22号染色体)的副缢痕即核仁组织者区(NOR)出现深染，称N带。严格地讲，AgNO3只能将具有转录活性的NOR染成黑色，这种银染阳性的NOR称Ag-NOR。无活性的NOR不被着色。因此N带技术可用于研究rRNA活性及其动态变化，另外也可做为观察近端着丝粒染色体的随体是否发生联合，因为随体联合是造成染色体不分离的原因之一。

　　T带将染色体标本加热处理后再用吉姆萨染料染色，可以使一些染色体末端区段特异性深染，称T带也称端带，它可专一显示染色体端粒，故此技术可应用于识别染色体末端微小畸变。

　　上述Q、G、R显带方法，可以恒定地显示人类24条染色体的特异性带型，表明带型的客观存在性和真实性，为识别染色体的改变提供了分析基础。

　　2、染色体显带核型的命名
显带技术的应用，进一步要求对显带染色体有一个统一识别、描述的标准，以便于相互交流。根据1971年在巴黎召开的第四届国际人类细胞遗传学会议的建议和1972在爱丁堡会议的决定，提出了区分每个显带染色体区、带的标准系统称《人类细胞遗传学命名的国际体制》(
ISCN，1971)。

　　界标(1and
mark)：是染色体上具有显著形态学特征的并且稳定存在的结构区域，是识别显带染色体的重要指标。它包括染色体两臂的末端、着丝粒及其在不同显带条件下均恒定存在的某些带。

　　区(region)：位于两界标之间的区域。

　　带(band)：每一条染色体都应看做是由一系列的带组成，即没有非带区。每一条带均可借较亮(深)或较暗(浅)的着色强度差异与相邻带相区别。

　　每一条染色体以着丝粒为界标区分为短臂和长臂。短臂和长臂上的区带均由着丝粒开始，沿着丝粒由近向远的方向进行编号命名。距着丝粒最近的两个区分别记为长臂或短臂的“l”区，由近向远侧依次为“2”区、“3”区等。每个区中带的编号也依此原则，即在该区中距着丝粒最近的带编号为该区的1带，依次为2、3带。有两种情况需说明，作为界标的带算作是此界标以远区的1带;被着丝粒一分为二的

　　带为分属长、短臂的两个带，分别记作长臂的1区1带和短臂的1区1带。

　　描述一特定的带时，需写明4个内容：①染色体号;②臂的符号;③区的序号;④带的序号。这些内容按顺序书写，不用间隔或加任何标点。例如，图6-4箭头所示为第一号染色体，短臂，3区，1带，书写为lp31。

　　应用染色体显带技术可以识别出多种染色体微细结构异常，如染色体的断裂、易位、倒位等，为了使描述这些变化时有一个统一格式，1997年在斯德哥尔摩召开的国际会议上议定的《人类细胞遗传学命名的国际体制》(1978、1981、1985)，提出了显带染色体命名符号和缩写术语体系(表6-2)，以便统一应用。

　　3、染色体高分辨显带及命名应用普通G显带分析的是细胞分裂中期染色体，此时染色体螺旋化程度最高，因此染色体收缩到最短，带纹往往发生融合，所显示的带纹数也较少。一般中期单倍染色体仅显示320条带。这种带纹水平上难以发现染色体细微的结构异常，这不能满足人类细胞遗传学研究和临床应用的要求。1975年以来，Yunis等建立起高分辨显带(high
resolution
banding)技术，即用甲氨蝶呤使细胞同步化，再用秋水仙胺短时间处理，获得许多处于前中期和晚前期染色体，再通过显带处理，使人的早中期单倍染色体显现出550～850条带，而晚前期则可观察到850～1
250条带。这些带纹都是由于细长的染色体螺旋化程度相对低，在320条带纹中融合的带纹被显现出来，因此极大程度的提高了染色体研究水平。以前在染色体上因为观察不到异常而认为是“单基因病”及其所表现的综合征，实际上是由于染色体的微小改变所致。例如，原来认为是AD遗传病的WAGR综合征是由于llpl4.1-p13片段发生缺失;Prader-Willi综合征也曾被认为是AD遗传病，实际是15q11.2的缺失和重排所致。又如，先天愚型的病因最早是由Weune(1959)确定为多了一条2l号染色体的结果，应用高分辨显带技术则进一步确定先天愚型的主要症状只与21q22.3这一微小片段的重复相关。这种应用高分辨显带技术研究染色体微细结构及结构改变后遗传效应的学科也称为微细胞遗传学。现在人们可以在Gz期或早前期的染色体上显示出3
000～10 000条带，这已接近一个细胞中所具有的结构基因的数目(约30 000个)，从而缩短了细胞遗传学与分子遗传学问的距离。

　　高分辨染色体命名表示法320条带水平的一条带通常在高分辨染色体中可被分出若干带――亚带。关于亚带的命名和表示法，ISCN(1981)规定，在ISCN(1978)中已命名的任何一条带所分出的亚带保持原有的区和界标的带号，每一条带再细分，要在原带号数之后加一个小圆点，并写出每一亚带的号数，其编号原则仍按从着丝粒向臂端序贯编号。例如，原来的lp3l带被分为3个亚带，应书写为lp31.1、1p31.2和1p31.3。

　　其中，lp31.1距着丝粒近，1p31.3距着丝粒远。如亚带再分为次亚带，则可在原亚带编号后再加数字，但不必再加标点。例如，亚带1p31.3再分时，则书写为1p31.3l、lp31.32和lp31.33。

　　三、人类细胞遗传学研究进展

　　综上所述，染色体显带技术进入到高分辨染色体显带水平，大大提高了对染色体的分析能力，但在光学显微镜下，也只能识别出4 500kb以上的DNA片段，而对4
500kb以下的染色体异常是无法辨认的。现在，运用分子生物学技术已经可以有效地对几十kb到2
000kb的DNA分子进行检测分析。因此，将分子生物学技术与微细胞遗传学相结合，对遗传病病因的分析及致病基因的鉴定具有重要的价值，而分子细胞遗传学即是用分子生物学方法，在微细胞学基础上，从分子水平来研究染色体的结构和畸变的遗传效应与

　　疾病发生等问题的学科，主要是用克隆的DNA探针去检测染色体。此技术是人类细胞遗传学研究的发展方向。

　　分子细胞遗传学的研究技术主要有以下几种：

　　1、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，：FISH) 此技术是在20世纪60年代所建立的原位杂交技术基础之上发展起来的。其方法是将一段已知的DNA序列用特殊荧光素标记后作为探针，与待测染色体DNA进行分子杂交，如果待测染色体上有与探针同源的序列，即可发生互补结合，那么在间期核或染色体原位上即显示杂交信号。FISH与一般原位杂交(ISH)技术相比，具有快速、安全、经济、灵敏度高和特异性强等优点。探针用非放射性荧光染色与抗体或蛋白质结合进行检测，不需要特殊的安全防护措施，标本可以长期保存而不失活，而且分辨率可达100～200kb，与放射性探针相同或更高。所以，FISH技术已广泛应用于基因定位、染色体畸变、基因扩增和整合到人体细胞中的病毒等外源基因的检测。例如，高分辨显带技术已表明，先天愚型病因是2lq22.3这一微小片段重复所致，利用显微切割技术将此片段切割下来，克隆出其中所含的DNA片段，用荧光标记DNA作为探针，即可在有高发风险的孕妇绒毛或羊水中胎儿的间期细胞上进行荧光原位杂交，以快速作出胎儿是否为先天愚型的产前诊断。目前，已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽，这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位和遗传病诊断的重要手段。

　　2、DNA纤维荧光原位杂交(DNA fiber-FISH) 此技术是新近建立的可目视的高分辨基因组制图技术，该技术的要点是先用碱溶液或甲醛溶液处理待测细胞，使间期核染色质的组织结构松散将染色质(丝)从核骨架中释放出来，以便在载玻片上制备出DNA纤维，然后将不同颜色荧光物质标记的特异性DNA探针分别与靶细胞上的DNA纤维杂交，据此判断各探针的定位方向及各探针间物理距离和重叠程度，作出基因定位。DNA
fiber-FISH与FISH分析检测染色体异常的步骤相同，但前者的优点是分辨率更高(1～500kb)，探针的长度可在1～300kb范围内。因此，DNA
fiber-FISH技术以广泛应用于人类基因组制图、染色体结构分析及染色体病、肿瘤和某些单基因病的分析研究中。

　　3、染色体涂染 染色体涂染是FISH和染色体原位抑制杂交(CISS)技术的结合，即用单链DNA和Cot-1来封闭基因组的重复序列以减少非特异性杂交信号，从而增强特异性杂交强度，并用染色体特异性DNA库作为探针池以不同荧光涂染整条染色体或染色体特异区域的新技术。

　　染色体涂染技术的基本步骤是以非同位素物质，例如，生物素(biotin)，将具有染色体特异性的DNA(整条染色体或某一染色体特异区域)进行标记，制备成DNA探针后，与靶细胞染色体进行原位杂交，然后再用带有荧光物质的链霉抗生物素蛋白进行抗原抗体反应来检测和放大，即可使待测的整条染色体或染色体区段显示出发荧光的杂交信号，从而可据此作出分析诊断。例如，为了分析涉及两条染色体的微细易位，可用地高辛-1l-duTp和普通的biotin分别标记这两条染色体，制成两种不同的DNA探针，杂交后再经抗原抗体反应来检测和放大，即可使同一核型中的两条染色体分别染成不同颜色(如一条为红色，另一条为绿色)，而相互易位形成的两条衍生染色体，每条染色体均有红、绿两种颜色则可清楚识别。这表明此新技术对分析人类染色体的复杂易位、肿瘤的细胞遗传学和基因定位等将具有广泛的应用前景和重要的应用价值。

　　4、比较基因组杂交(CGH) Kallioniemi(1992)和Manoir(1993)在FISH技术基础上建立了CGH技术。CGH技术的要点是把肿瘤基因组DNA(待测DNA)与正常对照组DNA分别标记上不同的非同位素标记物，然后将两者以1：1比例混合制成探针，同时与正常人外周血的有丝分裂中期染色体进行原位抑制杂交，杂交后分别以不同的荧光染料标记的探针进行检测。肿瘤。DNA一般标记为绿色，正常基因组DNA标记为红色。同某一染色体区域相杂交的肿瘤DNA与正常对照组DNA的相对量数值，依赖于两种样品中这一序列的含量，这可通过肉眼观察不同染色体区域中两种颜色的差别来大致判断该两种不同来源DNA相对拷贝数的多少，也可用荧光显微镜连接电脑彩色图像分析系统对红绿荧光比值进行定量检测，分析被检DNA序列的拷贝数变化，据此对肿瘤的基因数量不平衡情况，例如，肿瘤DNA扩增(绿色增强)或缺失(显红色而缺绿色)作出判断。这一新技术可在全部染色体或染色体亚带水平上对不同基因组间DNA序列拷贝进行检测、定位，也可以鉴定用细胞遗传学技术难以判断的肿瘤染色体的某些成分(如双微体、标记染色体)的来源，还可快速检出提供有关染色体三体型、单体型或染色体较大片段拷贝数变化的信息，从而有利于对先天愚型、自然流产等疾病进行快速诊断。