诱发细胞凋亡是中药抗肿瘤机理的一个重要环节。散结抗瘤方是我们临床总结出来的中药抗癌复方，以消Y化积、软坚散结为主要功效。为了明确此复方的抑瘤作用和机理，我们设计了本实验进行研究。补益法是治疗肿瘤常用的治法，在临床上用这种治法治疗肿瘤究竟是利是弊尚有争论。我们选择四君子汤作为补益药代表方剂，观察它的抑瘤作用和机理，并与散结抗瘤方对比。

　　通过建立荷瘤小鼠的动物模型和体外传代培养肿瘤细胞株，分别在体内和体外用中药来进行干预，观察荷瘤小鼠的瘤重变化，肿瘤细胞体外增殖的影响，用电镜和流式细胞术来观察该中药复方是否有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并用免疫细胞化学和原位杂交技术来检测bcl-2蛋白和MMP-2mRNA，阐明散结抗瘤方诱导细胞凋亡和抑瘤作用的可能机制。

　　一、散结抗瘤方对荷瘤小鼠（SRS-82）抑瘤作用的实验研究

　　1材料和方法

　　1.1实验动物：昆明种小鼠60只，体重20g±2g，雌雄各半，购自第一军医大学实验动物中心。分笼饲养，自由摄食、饮水，鼠房保持通风。

　　1.2细胞株：细胞株为小鼠SRS-82腹水瘤株，皮下接种可生成肉瘤。由本校药物研究所提供，常规复苏传代培养。

　　1.3药物组成和煎剂的制备：本实验所用中药均购自南方医院中药房。散结抗瘤方由浙贝、法夏、蜈蚣等等组成。四君子汤组成：人参9g，白术9g，茯苓9g，炙甘草6g。制备方法：常规水煎煮2次，所得水煎液经70℃恒温水浴蒸发浓缩，最后得到药液浓度分别为（含生药）：散结方1.57g/ml，四君子汤0.33g/ml。5-FU注射剂，0.25g/10ml，中国江苏南通制药总厂（苏卫药准字第241201号）制造。

　　1.4荷瘤小鼠模型的建立：体外复苏培养SRS-82细胞，在细胞的指数生长期收集细胞。随机选取10只健康昆明小鼠，每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射，约1周后接种小鼠腹部明显涨大、凸出，抽取腹水，用无菌生理盐水以1：2稀释，对48只昆明小鼠进行接种，每只用0.2ml稀释液接种于右后肢皮下。

　　1.5实验分组和给药：48只造模成功的小鼠随机分为4组，每组12只，组内编号。4组分别为：空白对照组，散结抗瘤方组，四君子汤组，5-FU组。所有处理自造模后第2天开始：散结抗瘤方组用已制备的散结抗瘤方煎剂灌胃，每只0.5ml，每日1次；四君子汤组用制备的四君子汤煎剂灌胃，每只0.5ml，每日1次；空白对照组每日用等量的生理盐水灌胃；5-FU组用稀释的5-FU注射剂腹腔注射，每只0.2ml，隔日1次。以上处理连续进行15天后，杀死小鼠，剥离瘤块。

　　1.6称瘤重并计算抑瘤率：剥离瘤块，电子天平称重，并计算抑瘤率。

　　1.7透射电镜观察肿瘤细胞形态结构：每组随机取2只小鼠做电镜观察。剥离瘤体后切取0.5mm3体积的瘤体组织，迅速固定、染色，将做好的电镜切片在透射电镜下观察。

　　1.8琼脂糖凝胶电泳：按常规方法作DNA的提取及电泳。

　　1.9统计学处理：本实验（下同）全部数据用统计软件SPSS（10.0）做统计处理。计量资料采用随机设计的方差分析，计数资料采用多样本等级资料的秩和检验做统计分析。

　　2、结、果

　　2.1瘤重和抑瘤率

　　各组瘤块重量及抑瘤率见表1。由表可见，各给药组与空白对照组相比瘤重明显减轻，其中以5-FU组抑瘤效果最明显，瘤重最轻；散结抗瘤方组次之，四君子汤抑瘤作用最弱。散结抗瘤方抑瘤效果明显优于四君子汤。

　　表1、各组平均瘤重及抑瘤率

　　实验分组

　　瘤重（g）（、±s）

　　抑瘤率（％）

　　空白对照组

　　4.78±1.53

　　四君子汤组

　　4.03±1.23*

　　15.69

　　散结抗瘤方组

　　3.42±0.96**△

　　28.45

　　5-FU组

　　3.12±1.08**△△

　　34.1

　　*与空白组比较P<0.05，**与空白组比较P<0.01

　　△与四君子汤组比较P<0.05、△△与四君子汤比较P<0.01

　　2.2透射电镜观察结果

　　在散结抗瘤方组所选取的瘤体切片中，可见有大量细胞发生凋亡特征性改变：细胞核固缩、碎裂，染色质聚集，胞浆浓缩，有空泡形成，细胞器结构基本完好，包膜完整。其余各组的切片大部分是呈现坏死细胞的改变：染色质淡染，细胞器肿胀，空泡样变。观察结果可以说明散结抗瘤方在体内的抑瘤作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

　　2.3琼脂糖凝胶电泳

　　散结抗瘤方组瘤体的DNA电泳带呈明显的梯状条带。其余3组的电泳带均未见到同样条带。DNA梯状条带是细胞发生凋亡的特征性改变。

　　二、散结抗瘤方体外作用SRS－82瘤株的实验研究

　　1材料与方法

　　1.1实验动物和瘤株：4～6周龄SD大鼠24只，均为雄性，体重为200g±20g，由南方医院动物中心提供，自由摄食饮水，动物房保持通风。瘤株为SRS-82细胞株，为小鼠腹水瘤细胞株，接种皮下可生长成肉瘤。由本校药物研究所提供。

　　1.2药品组成及制备方法同第一部分。

　　1.3大鼠含药血清的制备：24只大鼠随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组，四君子汤组，散结抗瘤方组，5-FU组。散结抗瘤方组和四君子汤组分别每日给予相应中药煎剂2ml灌胃，空白对照组给予同等剂量的生理盐水，5-FU组每日用已稀释的药液隔日腹腔注射，每次1ml（150mg/kg），以上处理连续7日。最后一次灌药（灌药前禁食不禁水12h）和腹腔注射1h后，3％戊巴比妥（1.5ml/kg）腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000r/min×20min离心分离血清，56℃水浴30min灭活，0.45μm微孔滤膜过滤，-70℃冷冻保存。

　　1.4、SRS-82细胞活力的测定：取复苏后常规传代培养的SRS-82细胞株，分别加入0.1ml已制备的大鼠含药血清、空白对照组血清。共分为4组：空白血清组，散结抗瘤方组，四君子汤组和5-FU组，均置37℃、5％CO2、培养箱中孵育24小时后，MTT法检测细胞活力，计算细胞增殖抑制率。

　　1.5流式细胞仪测定细胞凋亡率：药物血清培养后，分组同上，PI单染色，上机检测，分析PI荧光的直方图。

　　1.6免疫细胞化学法检测BCL-2蛋白：玻片经预处理，将药物血清分组培养的细胞放入预先处理好的盖玻片条，让细胞在盖玻片上爬行生长，继续培养12h后取出盖玻片进行染色，封片，显微镜下观察。

　　1.7、原位杂交技术检测MMP-2含量：预处理原位杂交专用玻片，细胞爬片的制备同上。细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，固定，暴露mRNA核酸片段，杂交，洗涤，滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛SABC、生物素化过氧化物酶，DAB显色，封片。

　　1.8统计学处理同上。

　　2、结果

　　2.1细胞活力的测定

　　实验各组OD值见表2。由表可见，经散结抗瘤方组和5-FU组含药血清作用过的细胞活力较空白血清组明显降低（与空白血清组比较，P<0.01），对肿瘤细胞的增殖抑制率分别为26.5％和34.8％，其中以5-FU血清组抑制肿瘤细胞增殖作用最为显着（与散结抗瘤方血清组比较，p<0.01），散结抗瘤方抑瘤作用优于四君子汤。四君子汤对该肿瘤细胞没有明显的抑制作用，该组细胞活力与空白组比较无显着差别（P>0.05）。

　　表2、、、含药血清对SRS-82细胞株增殖活力的影响

　　实验分组

　　OD值（、±s）

　　增殖抑制率（％）

　　空白血清组

　　0.712±0.025

　　四君子汤组

　　0.735±0.016*

　　-3.2％

　　散结抗瘤方组

　　0.523±0.024**

　　26.5％

　　5-FU组

　　0.463±0.019**△

　　34.8％

　　*：P>0.05（与空白组比较）**：P<0.01（与空白组比较）

　　△：P<0.01（与散结抗瘤方血清组比较）

　　2.2流式细胞仪检测

　　散结抗瘤方血清组呈现明显的亚二倍体峰，而其余各组均未见到。各组凋亡细胞百分数见表3。与空白血清组相比，散结抗瘤方组细胞凋亡率明显升高（p<0.01），其余两组与空白血清组比较均无显着差别（p>0.05）。

　　表3、各组凋亡细胞百分数

　　分组

　　正常细胞（％）

　　凋亡细胞（％）

　　空白血清组

　　83.39

　　11.11

　　散结抗瘤方组

　　14.29

　　33.68**

　　四君子汤组

　　82.53

　　12.25*

　　5-FU组

　　37.24

　　13.35*

　　**：p<0.01（与空白血清组比较）

　　*：p>0.05（与空白血清组比较）

　　2.3、bcl-2蛋白的表达强度

　　细胞被染成棕黄色者为基因表达阳性细胞，400倍显微镜下计数400个细胞，按阳性细胞所占百分比分为4个等级，（―）：阳性细胞数<5％；（＋）：阳性细胞数5％～10％；（＋＋）：阳性细胞数11％～50％；（＋＋＋）：阳性细胞数>51％。

　　结果见表4，由表可见，散结抗瘤方血清组bcl-2表达明显下降，与空白血清组、四君子汤组及5-FU组比较有显着差别，而其余三组之间比较未见明显差别。此结果提示SRS-82细胞经散结抗瘤方血清作用后，可使bcl-2基因表达显着下调。

　　表4、bcl-2基因表达强度

　　实验分组

　　例数（n）

　　染色强度

　　－~±

　　＋

　　＋＋

　　＋＋＋

　　空白血清组

　　10

　　1

　　0

　　7

　　2

　　四君子汤组*

　　10

　　0

　　2

　　8

　　0

　　散结抗瘤方组**

　　10

　　7

　　2

　　1

　　0

　　5-FU组*

　　10

　　1

　　2

　　5

　　2

　　*：（与空白血清组比较）P>0.05。

　　**：（与空白血清组比较）P<0.01

　　2.4、MMP-2mRNA的表达强度

　　MMP-2、mRNA阳性的细胞胞浆着色呈棕黄色。显微镜下计数方法同上。由表5可见，MMP-2、mRNA表达在空白血清组、四君子汤组、散结抗瘤方组和5-FU组4组之间比较均无显着差异（P>0.01）。

　　表5、MMP-2、mRNA表达强度

　　实验分组

　　例数（n）

　　染色强度

　　－~±

　　＋

　　＋＋

　　＋＋＋

　　空白血清组

　　10

　　0

　　8

　　2

　　四君子汤组*

　　10

　　0

　　2

　　8

　　0

　　散结抗瘤方组*

　　10

　　1

　　1

　　7

　　1

　　5-FU组*

　　10

　　0

　　2

　　6

　　2

　　*：（与空白血清组比较）P>0.05。

　　三、讨、论

　　1、散结抗瘤方主要成分为法夏、浙贝等软坚散结药和蜈蚣等以毒攻毒药，关于这两类药的抗肿瘤作用已有很多文献报道，证实在体内外都有明显的抑瘤作用[1]。我们的体内实验也证实散结抗瘤方对于荷瘤小鼠（SRS-82）有明显的抑瘤效果，抑瘤率达到28.45％。四君子汤组瘤重与空白组比较也有显着差别，抑瘤率为15.69％，稍低于散结抗瘤方组，而且两组比较仍有显着性差异，说明在对荷瘤小鼠（SRS-82）的体内实验中，散结抗瘤方的抑瘤作用要强于四君子汤。散结抗瘤方以“攻邪”为主，可以直接抑制肿瘤生长。四君子汤以补益为主，直接攻邪作用弱。临床使用中也观察到疗效有差异。很多文献报道，补益药在体内实验中对荷瘤动物模型的免疫功能、生存时间等都有积极的作用，说明补益药是通过间接作用而达到治疗肿瘤的目的[2]。

　　在实验中通过电镜下观察和琼脂糖凝胶电泳的检测，散结抗瘤方组出现了较为明显的凋亡特征标志。空白对照组、四君子汤组与5-FU组则没有见到典型的凋亡改变。表明散结抗瘤方在荷瘤小鼠体内表现出明显的抑瘤活性，其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。

　　2、含药血清抑制SRS-82细胞增殖

　　本实验检测细胞活力的结果表明，散结抗瘤方也可以明显的抑制肿瘤细胞增殖，经散结抗瘤方组含药血清作用过的细胞活力较空白血清组明显降低，对肿瘤细胞的增殖有明显抑制作用，散结抗瘤方优于四君子汤。四君子汤对该肿瘤细胞没有明显的抑制作用，体内实验中四君子汤组有明显的抑瘤作用，这可能通过整体其它途径起作用。

　　3、散结抗瘤方对肿瘤细胞凋亡和bcl-2基因表达的影响

　　我们得到的结果说明：散结抗瘤复方在体外有显着的诱导SRS-82细胞凋亡的作用，其抑制肿瘤细胞生长的机制也可能与诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。此结果证明散结抗瘤方中有软坚散结和以毒攻毒功效的攻邪类中药对肿瘤细胞有明显的促进凋亡效应，诱导凋亡可能是此类中药抗肿瘤的部分作用机制。补益的四君子汤组和5-FU组均不能引起SRS-82肿瘤细胞凋亡。

　　SRS-82细胞经散结抗瘤方血清作用后，可使bcl-2基因表达显着下调，据此我们认为该复方体外诱导肿瘤细胞凋亡可能与bcl-2蛋白含量下降密切相关。通过影响肿瘤细胞中bcl-2基因的表达，降低胞浆中bcl-2蛋白的含量，从而可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进细胞凋亡的发生[3]。

　　4、散结抗瘤方对MMp-2的影响

　　本实验中药复方含药血清组（包括散结抗瘤方和四君子汤）和5-FU组对SRS-82细胞的MMP-2的含量没有显着影响，散结抗瘤方在体外抑制肿瘤的机制可能与MMP-2无关，散结抗瘤方不能抑制肿瘤细胞MMP-2的活性。

　　四、结论

　　1、属于攻邪的散结抗瘤方和补益的四君子汤均可以显着抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，证明攻补两类中药在体内均有明显的抑瘤作用，但攻邪类药物作用更强。

　　2、散结抗瘤方在体外对肿瘤细胞有明显的抑制增殖作用，而四君子汤体外对肿瘤细胞则没有明显抑制作用。散结抗瘤方对肿瘤细胞有直接杀伤和细胞毒作用，四君子汤则没有这方面的作用。这说明攻邪类中药对肿瘤细胞能直接产生抑制和杀伤作用，补益药则没有这种直接作用。

　　3、散结抗瘤方抑瘤作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。体内和体外实验均有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。补益的四君子汤体内和体外均没有这方面的作用，其对肿瘤的影响可能通过其他途径。

　　4、散结抗瘤方诱导凋亡的机制可能与下调抑制凋亡基因bcl-2的表达有关。

　　5、散结抗瘤方和四君子汤对肿瘤细胞MMP-2的含量没有影响，这两类中药的抑瘤机理可能与此无关。