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作者
抗磷脂抗体(anti-phospholipid antibody，APA)是一族自身免疫性抗体，以抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody，ACA)和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)为主，为妊娠丢失的主要免疫因素之一。研究显示中医药在免疫调节方面发挥重要作用。本研究采用动物实验的方法，初步观察了补肾活血方-丹寿汤对APA致孕鼠妊娠丢失的影响。河南中医学院第一附属医院生殖中心卫爱武
材料与方法
1.动物 采用SPF级健康雌、雄SD大鼠各120只，10周龄，雌鼠体重200g±10g，雄鼠体重250g±20g，河南省实验动物中心提供（合格证号0009881）。雌、雄大鼠按1：1合笼，次日清晨发现阴栓或阴道涂片发现精虫者定为妊娠第0天，共受孕100只，作为入选实验动物，所有SD大鼠均喂养在恒温、恒湿的清洁环境中，环境温度为26℃，湿度为70％，每天12h光照/黑暗。
2.药品 补肾方（|丝子32 g，川断16 g，桑寄生16 g，阿胶16g），活血方（丹参20 g，降香20 g），丹寿汤（以上两方相合），水浓煎，按人鼠体重比换算，分别制成含生药1g/ml、0.67g/ml 、0.34g/ml浓煎液备用。由河南中医学院第一附属医院制剂室制备。
3. 人血清收集及纯化
3.1血清收集的入选标准
2007年3月C9月就诊于河南中医学院第一附属医院的门诊及病房的复发性流产患者，经ELISA检测血ACA阳性，定量检测为中、高度；同期在门诊及病房的系统性红斑狼疮（SLE）患者，经单抗的狼疮抗凝物活性检测阳性者；健康人的血清。
3.2血清收集的排除标准
（1）ACA阳性的病人，应排除引起流产的其它原因；（2）SLE患者，应排除ACA阳性及其他抗体阳性者；（3）以上三种人群，同时均应排除合并其他各种疾病，且近期未经药物治疗者，经患者同意留取血清。
3.3提纯及蛋白溶液浓度测定 经二次盐析法蛋白液提纯后，用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，在280nm下测定溶液OD值，参照公式：蛋白质质量浓度（mg/ml）=1.2×OD280nm，求得溶液中蛋白质质量浓度[1]。配成质量浓度为15 mg/ml蛋白液（相当于75mg/(kg・d)），于-20℃分装保存。
4. 动物造模、分组及给药方法 模型复制参考Holers[2]的造模方法并加以改良。将受孕鼠100只随机分为两组，每组50只，每组又分补肾活血组（A）、补肾组（B）、活血组（C）、模型组（D）、空白孕鼠组（E），A、B、C组自发现阴栓之日起给予丹寿汤、补肾方、活血方浓煎液，D、E组予生理盐水，4ml/d，分2次灌胃，共15日，其间A、B、C、D组分别于孕8天、孕12天背部多部位皮下注射ACA纯化蛋白液、LA纯化蛋白液15mg/(ml・d)，E组则分别于孕8天、孕12天背部多部位皮下注射同量正常人血清。所有动物于孕15日处死取材。
3.观察指标及检查方法
3.1 鼠血ACA水平测定 于孕15天取腹主动脉取血3ml，采用酶联免疫法检测血清ACA水平，并用酶标仪测OD值。（ACA酶联免疫法检测试剂盒，深圳市赛尔生物技术有限公司生产，批号20070721）。
3.2鼠血单抗的狼疮抗凝物活性测定 于孕15天取腹主动脉取血1.8ml，参考文献[3] 采用终点凝集法测定活化的部分凝血酶原时间（APTT）来检测其活性。（半自动计时仪，Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ；鼠单抗试剂盒MABTEST，Adiatec SA,Diagnositic }Biotechnologies,LA,法国, 货号20070091）
3.3 胚胎称重 乌垃坦麻醉后，开腹分离鼠胚胎，用精密电子天平称湿重。
3.4胚胎吸收率的检测 参考文献[4-5]，计算胚胎吸收率（胚胎吸收率=被吸收胚胎个数/被吸收胚胎个数+未被吸收胚胎个数×100%）。
3.5 胎盘病理学检测 剥离部分胎盘用4%多聚甲醛固定24-48h，常规石蜡包埋、切片（厚度4um），ACA阳性妊娠丢失模型组HE染色及SP免疫组化染色，LA阳性妊娠丢失模型组HE染色，HMLAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统进行图像采集。
3.6 统计分析 运用SPSS13.0软件进行分析，所有数据均进行方差齐性检验，两组间数据均采用t检验。
结果
1. ACA阳性、LA阳性孕鼠不同组别胚胎吸收率、胚胎重量、ACA及LA活性比较，见表1、2。
与D组相比，（1）A、B及C组的胚胎吸收率、ACA及APTT水平均降低（P<0.01），但三组中以A组下降显著（P<0.05），且与E组差异无统计学意义。（2）A组及C组的胚胎重量有明显增加（P<0.01，P<0.05），且仅A组的胚胎重量与E组无统计学意义（P>0.05）。提示补肾活血方优于补肾方或活血方。
2.各组鼠胎盘组织病理学观察 （1）免疫组化切片 E组未见褐色ACA免疫复合物沉积；ACA妊娠丢失D组鼠胎盘组织可见不同程度棕褐色ACA免疫复合物沉积，并有细胞核固缩、核碎裂现象，提示胎盘组织变性、坏死；B组、C组均较D组有明显改善；A组未见胎盘组织变性、坏死现象。（2）HE染色病理切片 E组胎盘组织细胞排列整齐、结构清晰、血窦丰富均匀；LA、ACA妊娠丢失D组胎盘组织不同程度变性、坏死，滋养细胞层可见炎性细胞浸润，胎盘血管内不同程度纤维素凝结及静脉淤血，提示胎盘血液循环障碍；B组、C组均较模型组病理现象有明显改善，而A组胎盘病理基本正常。
表1 ACA阳性孕鼠不同组别胚胎吸收率、胚胎重量、ACA水平变化
组别
孕鼠个数
胚胎吸收率
胚胎重量
ACA 水平OD值
A组
10
0.03±0.03＊＊
0.38±0.05＊＊
0.10±0.03＊＊
B组
10
0.12±0.08＊＊#
0.32±0.06△
0.19±0.05＊＊##△
C组
10
0.10±0.04＊＊#
0.29±0.10＊△
0.22±0.04＊＊##△
D组
10
0.21±0.09
0.23±0.04
0.32±0.05
E组
10
0
0.39±0.06
0
注：与D组比较，＊P<0.05, ＊＊P<0.01；与E组比较，△P<0.01
与A组比较，#P<0.05，##P<0.01
表2 LA阳性孕鼠不同组别胚胎吸收率、胚胎重量、LA活性比较
组别
孕鼠个数
胚胎吸收率
胚胎重量
APTT（S）
A组
10
0.01±0.03＊＊
0.42±0.03＊＊
20.03±0.78＊＊
B组
10
0.08±0.07＊＊ #
0.34±0.06△
21.40±1.11＊＊##△
C组
10
0.06±0.07＊＊ #
0.36±0.06＊△
21.31±1.18＊＊##△
D组
10
0.19±0.06
0.32±0.04
24.34±1.31
E组
10
0
0.43±0.04
19.86±0.95
注：与D组比较，＊P<0.05, ＊＊P<0.01；与E组比较，△P<0.01
与A组比较，#P<0.05，##P<0.01
讨论
妊娠丢失常表现为复发性流产、死胎或胎儿宫内发育迟缓等，除外遗传、解剖、内分泌因素，其与免疫因素有密切关系，APA为其免疫因素之一。目前，APA致妊娠丢失的确切机理尚不十分清楚，但大多倾向于血凝学说。动物实验证实，APA阻止前列环素合成，使血栓素/前列环素比值失调，导致血液高凝、血栓，尤其以胎盘循环为主，可引起胎盘血栓的形成及胎盘梗死，从而造成胎盘功能减退，出现胚胎吸收、宫内发育迟缓等[6-7]。对其治疗临床主要采用阿司匹林、肝素、强的松等，但这些药物潜在的副作用使患者感到恐慌。
祖国医学有“堕胎”“滑胎”“胎萎不长”“子死腹中”的病名，类似现代医学之妊娠丢失的表现。中医认为，以上疾病由冲任损伤所致。冲任隶属于肾，且肾主生殖，任主胞胎，故肾虚无力系胞为病之本。然若肾阳虚失却温煦，或阴虚生热，热灼精血致血滞不行或屡堕冲任损伤，瘀血阻络，致胎失所养，为病之标。《内经》“四乌贼骨一茹丸”打开了补肾活血法的先河，更有张锡纯指出“肾气丸为补肾之药，实兼为开瘀之药”，认为补肾与活血药有机的结合具有相互促进的作用。基于此建立补肾活血安胎的原则，并拟定补肾活血方-丹寿汤，方以寿胎丸加丹参、降香组成。方中|丝子、丹参为君，补活结合，相得益彰；臣以寄生、续断益肾安胎，增加固护冲任之功，佐以降香助丹参活血行血，阿胶补血止血，以血养胎，并防活血化瘀之药散血之虑，一补一行，标本皆治，共奏精血生、气血行而安胎之效。现代研究也显示，|丝子能促进卵巢黄体激素的增加，增强体液免疫功能，并有类似雌激素样作用，能抑制免疫球蛋白的产生；桑寄生及续断均含有丰富的甾醇和甾酮，有利于子宫和胚胎的发育及抑制子宫收缩的作用；阿胶含多种微量元素，能提高巨噬细胞的资赡芰Γ坏げ巍⒔迪隳芙档兔飨愿纳颇谠嗉巴庵芪⒀罚种颇钥寡ǖ男纬桑銮棵庖撸俳逡好庖叻从[8]。本研究结果显示，补肾活血方较单纯补肾方、活血方更能有效地降低APA滴度，从而改善胎盘微循环，降低胚胎吸收率，增加鼠胚胎重量，提高再次妊娠的成功率。
参考文献：
[1] 洛恩 E，莱恩 D.抗体技术实验指南 [M]．北京：科学出版社，2002：9.
Luoen E,laien D.Antibody Technology Experimental Guide[M].Beijing:Science Press,2002:9(自译)
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Chen Xiaoxiang,Yang Chengde,Gu Yueying,et,al.The experimental study on antiphospholipid antibody induced by plasmin.Chin J Rheumatol. 2006, 10 (6):321-326
[4]周跃华,朱晓勇,李大金,等.孕早期干预CD80／CD86协同刺激信号对自然流产模型免疫活性细胞协同刺激分子表达的影响.中国免疫学杂志，2004，20（8）：537-543.
Zhou Yue-Hua,Zhu Xiao-yong,LI Da-jin,et al.Effects of blocking in vivo CD80／CD86 costimulatory signal at the early gestation on the costimulatory molecules expression of immumo-competent cells in the abortionprone model.Chinese Journal of Immunology,2004,20(8):537-543.
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Lin YiR,Zeng Yao-ying ,Zeng Shan et al .eduction of embryo resorption with macrophage toxin in CBA／J×DBA／2 Mice. Lin Yi，Zeng Yao-ying，Zeng Shan，et al.Journal of Jinan University(Natural Science)，2002，23（1）：93-98.
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[8]王再谟，傅荣周，唐章全．现代中药临床应用．北京：人民卫生出版社，2005：259-396
Wang Zaimo,Fu Rongzhou,Tang Zhangquan.Modern Chinese Traditional Medicine Clinical Apply. Beijing :People’s Medical Punishing House, 2005：259-396(自译)
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