肺隐球菌病(pulmonary cryptococcosis,PC)是由新生隐球菌感染引起的急性、亚急性或慢性肺部真菌感染,临床表现无特异性,很难和细菌性肺炎、肺结核和肺部肿瘤等疾病相鉴别,非常容易误诊。在国外,动物实验和临床研究均已证实:血清乳胶凝集试验(latex agglutination test,LA)检测隐球菌荚膜多糖抗原对肺部隐球菌感染具有很高的诊断价值,敏感性和特异性达93-100%,但国内没有相关的研究报告。我们应用血清乳胶凝集试验和肺活检组织病理检查进行临床对照试验,以探讨乳胶凝集试验对肺隐球菌病诊断的临床意义。
对象与方法
一、对象
2000年7月至2007年7月北京大学第一医院住院患者共27例,均非获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者,根据临床表现和影像学特点,疑诊为肺部隐球菌感染。其中男性14例,女性13例,年龄在20~70岁之间,平均为49岁。
二、方法
27例患者全部进行血清乳胶凝集试验和肺活检组织病理检查,并分析肺隐球菌患者的临床表现和影像学特点,对其进行治疗和随访。
1.仪器和试剂:(1)美国Immuno-Mycologics有限公司生产的隐球菌抗原乳胶检测系统;(2)水冲或隔热设备(56℃);(3)100 rpm旋转仪器;(4)木制涂棒;(5)12×75mm非硅酸盐试管;(6)5ml无抗凝采血管。
2. 血标本采集:常规操作方法收集全血无菌无抗凝管静脉血约4ml(室温下允许收集管中血样凝集10min),1000×g角转速离心15min,小心吸取血清溶液加入无菌容器密封,在-20℃冰冻保存待检。
3.隐球菌抗原乳胶凝集试验:(1)在50 ul链霉蛋白酶部分中加入300 ul血清并用封口膜密闭管口;(2)56℃孵育血清/链霉蛋白酶溶液30 min;(3)加入1滴链霉蛋白酶抑制液终止反应;(4)在环状薄片的分离环中分别加入25 ul隐球菌抗原阳性对照,阴性对照和经链霉蛋白酶处理的血清样本;(5)每个环中加入25 ul隐球菌乳胶;(6)利用分离的涂药棒彻底混合环中物质;(7)室温下100 rpm旋转仪器5 min;(8)在无光背景中立即读取结果。
4. 肺组织活检[5]:采用CT或B超引导下经皮肺穿刺活检。肺组织标本应用4%甲醛液固定,石蜡包埋,组织切片,分别行HE染色、PAS染色和抗酸染色。
实验结果
1. 肺组织病理检查:肺隐球菌病患者9例,HE染色显示肉芽肿性病变,PAS染色可发现染色阳性的隐球菌病原体。非隐球菌病患者18例,其中肺结核6例,3例抗酸染色阳性,另外3例可见干酪样坏死;肺部恶性肿瘤9例,其中肺腺癌5例(包括细支气管肺泡癌2例),小细胞肺癌1例,原发性肺淋巴瘤1例,肺转移癌2例;结节病1例;闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(BOOP)2例。
2. 肺隐球菌病的临床表现:其中3例患者无临床症状,均为体检胸片发现肺部阴影,病史超过3个月,为慢性感染,其中1人为脑梗塞,1人经常洗桑拿浴;5例患者有临床症状,如发热、咳嗽、咳痰、胸痛等,病史3周至3个月之间,为亚急性感染,其中1人为早孕,1人为2型糖尿病;最后1例为急性重症肺炎,伴有进行性加重的呼吸困难和Ⅰ型呼吸衰竭。患者因“斑秃”口服强的松20mg/d和甲氨蝶呤7.5mg/w共2年,饲养鹦鹉3年。所有患者均无脑膜炎症状。
3. 肺隐球菌病的影像学特点:无症状患者多表现为孤立性或多发性结节状阴影,可伴有晕征,病灶相对稳定;有症状患者表现为多发斑片状浸润影或实变影,周围伴有明显的晕征,病灶往往有融合变大;急性重症患者表现为双肺浸润影,很快进展为大叶性实变。所有患者的肺部病灶多位于肺野外带,实变病灶可见支气管气相和空泡征,无坏死空洞形成。胸痛者病灶往往累及胸膜。
4. 血清乳胶凝集试验结果:经病理证实的肺隐球菌病9例,乳胶凝集试验全部阳性;非隐球菌感染患者18例,乳胶凝集试验全部阴性。乳胶凝集试验的敏感性和特异性均为100%。
因为大部分患者就诊的时间相对较晚,或院外误诊的时间较长,大部分在病程的第1-4个月检测,最早的在病程第8天,3例在肺穿刺前已临床诊断。3例行脑脊液(CSF)乳胶凝集试验,1例阳性,CSF压力明显升高,经两性霉素B治疗后2周后乳胶凝集试验转阴,压力恢复正常。5例患者同时检测曲霉菌抗原(半乳糖甘露聚糖,GM试验),4例阴性,1例为高滴度阳性,I = 6.54(<1.5)。临床表现为重症肺炎,肺活检病理为肺隐球菌病,无曲霉菌感染,肺组织培养为隐球菌纯培养。治疗的1周后GM试验转阴,乳胶凝集试验持续阳性。2例检测1,3-β-D葡聚糖(G试验),均为阴性。
5. 肺隐球菌病的治疗和随访:除1例急性重症患者应用两性霉素B治疗以外,其余患者均应用氟康唑400 mg/d治疗3-9个月,均临床治愈。
4例患者进行了监测,乳胶凝集试验阳性持续时间分别为2个月、5个月、6个月和12个月,肺部病灶消失的时间分别为1个月、4个月、5个月和10个月。急性或亚急性患者病灶吸收相对较快(1-4个月),慢性患者病灶吸收很慢(6-12个月)。也有1例肺内病灶长期不吸收者,乳胶凝集试验持续阳性。
讨 论
自然界中的新生隐球菌广泛存在于土壤及禽粪中,没有荚膜,易形成气溶胶,可经呼吸道吸入到达肺泡,引起肺隐球菌病(pulmonary cryptococcosis,PC)。在人体组织内的隐球菌则形成一层厚厚的荚膜,不易气溶胶化,因此本病从未发现人和人之间的传播。根据其荚膜抗原性的不同,新生隐球菌有A、B、C、D 4个血清型,在我国临床分离的菌株约70 %属A型,B型和D型各占15 %和5 %,无C型。
肺隐球菌病临床症状无特异性,大部分患者无症状或仅有轻微的呼吸道症状,少数免疫功能受损患者表现为重症肺炎。而痰涂片、痰培养和血培养的隐球菌检出率极低,支气管镜检查阳性率也不到10 %。由于影像学表现为单发或多发性结节状阴影,临床极易误诊为原发性肺癌、肺转移癌、肺结核和肺炎等其他疾病。
乳胶凝集试验(latex agglutination test,LA)是以高效价的抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶上,从而检测血清或CSF标本中的隐球菌荚膜抗原。血清型不同,能够检测到的最低值也不同。我院采用的试剂能检测到血清型A、B、C、D 抗原的低限分别为0.5 ng/ml、0.5 ng/ml、25 ng/ml 和0.5 ng/ml。国外的研究显示血清乳胶凝集试验对肺隐球菌病的敏感性和特异性达93-100%。
以前由于受血清中类风湿因子(rheumatoid factor,RA)的影响,可能会导致假阳性反应。现在我们应用链霉蛋白酶预处理标本,可以消除RA和其它免疫复合物的影响,减少干扰反应,提高实验的敏感性和特异性。本组的研究发现:经病理证实的肺隐球菌病9例,乳胶凝集试验全部阳性,非隐球菌感染患者18例,全部阴性。乳胶凝集试验的敏感性和特异性均为100%。
有作者认为血清乳胶凝集试验阳性,提示隐球菌感染出现血行播散,但是也有作者持相反的观点。本组病例血清乳胶凝集试验全部阳性,但只有1例重症患者感染累及脑膜,其它均未发现感染播散的证据。乳胶凝集试验可以用来监测病情和估计预后。通常在疾病的进展期,抗原的滴度会增高,而经有效治疗后,抗原的滴度会下降;治疗不彻底及复发者通常伴有连续几次标本滴度不变或升高。在成功治愈后,多数患者阳性反应仍将持续6个月。可能是因为死亡的新生隐球菌在CSF中清除缓慢,继续释放荚膜抗原的缘故。当抗原滴度用来监测疗效时,必须使用同一厂商提供的试剂盒。
我们对部分病例进行了监测,大部分在肺内病灶消失后1-3个月,乳胶凝集试验转为阴性。如果患者肺内的病灶持续不吸收,血清乳胶凝集试验将持续阳性。肺隐球菌患者血清乳胶凝集试验的滴度,可能和肺内病灶的体积以及其内病原体的数量有关。肺隐球菌病治疗的目标是消除症状,防止复发,肺内病灶逐渐吸收或稳定,而不必等待肺内病灶完全吸收和乳胶凝集试验转阴。
CSF乳胶凝集试验对诊断隐球菌脑膜炎具有更高的敏感性和特异性。CSF墨汁染色镜检、培养或乳胶凝集试验中的任何一项阳性,均可诊断为隐球菌脑膜炎。本组患者中3例进行了CSF检测,其中1例重症患者的CSF乳胶凝集试验阳性,同时伴有CSF压力升高。经两性霉素B治疗后2周后CSF恢复正常。美国感染疾病学会(IDSA)指南推荐所有隐球菌感染患者均要进行CSF检测,以决定治疗原则。但也有作者认为免疫功能正常、无或轻微症状的肺隐球菌患者,可以不进行CSF检查。
本组病例的部分患者还检测了1,3-β-D葡聚糖(G试验)和半乳糖甘露聚糖(GM试验)。2例G试验全部为阴性。因为新型隐球菌细胞壁中含有的1,3-β-D葡聚糖较念珠菌和曲霉菌少,另外在其外面包裹了一层厚厚的荚膜,很难将1,3-β-D葡聚糖释放到血液中,所以G试验为阴性。5例中GM试验,4例阴性,1例呈高滴度阳性,治疗1周后转阴。这是因为新型隐球菌荚膜抗原和曲霉菌半乳糖甘露聚糖具有交叉抗原性,当血中出现高滴度隐球菌荚膜抗原的时候,GM试验可出现阳性。但是曲霉菌感染不会导致乳胶凝集试验阳性。因此,当二者均为阳性时往往提示为新型隐球菌的严重感染而非二者的混合感染。
当然,肺隐球菌病的最终确诊还要依靠组织病理学。肺隐球菌病灶一般位于肺野外带,行CT或B超引导下经皮肺穿刺安全可行。但对于重症患者,早期可能没有形成可供穿刺的肺部病灶,也可能无法耐受肺穿刺,导致临床诊断困难。此时,血清乳胶凝集试验作为一种早期无创的诊断方法,具有很大的优势。并且还可作为一种筛查和监测方法,为临床的诊断和治疗提供帮助。
结论
乳胶凝集试验检测血清隐球菌荚膜多糖抗原对肺部隐球菌感染具有很高的诊断价值。血清乳胶凝集试验阳性,结合临床和典型的影像学表现,可以临床诊断肺隐球菌病。血清乳胶凝集试验和经皮肺穿刺相结合的方法,使肺隐球菌病的诊断变得十分完善。
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