[摘要]  目的  探讨声带息肉病变组织中成纤维细胞、胶原纤维、弹性纤维超微结构改变。 方法  对手术切除的10例声带息肉和3例正常声带对照（下咽癌行全喉切除见声带未受肿瘤侵犯）行透射和扫描电镜观察。透射电镜采用常规方法；扫描电镜采用组织消化法，观察弹性纤维的标本用90％甲酸消化，观察胶原纤维的标本用10％NaOH水溶液消化。 结果  透射电镜下声带息肉固有层中成纤维细胞数量增多，细胞器丰富，可见大量内质网、高尔基复合体、线粒体，表明成纤维细胞处于功能活跃状态。固有层内可见炎性细胞浸润,提示炎症反应与发病有关。声带息肉中血管数量明显增多。扫描电镜观察，声带息肉中胶原纤维和弹性纤维的形态发生改变，纤维排列紊乱。 结论  声带息肉中成纤维细胞、弹性纤维、胶原纤维形态改变，可能是影响声带发声功能的病理学基础。
　　[关键词]  声带; 息肉；  成纤维细胞；  胶原；  弹性蛋白
　　声带在组织学上分为三层：上皮层、固有层、肌层，其中固有层对维持声带振动和黏膜波产生以及正常发音功能有重要作用。固有层由少量细胞和细胞外基质组成，细胞外基质成分包括纤维（胶原、弹性、网状纤维）、糖蛋白和蛋白聚糖，后两者合称间隙蛋白。正常情况下，细胞外基质主要由成纤维细胞生成，其生成和降解处于动态平衡。病理情况下，基质的合成和周转失调，导致发声障碍。本研究对手术切除的声带息肉标本，进行透射电镜和扫描电镜观察，主要观察正常声带和声带息肉的超微组织学结构，特别是成纤维细胞、弹性纤维和胶原纤维的形态学变化。
　　材料与方法
　　一、研究对象
　　选取解放军总医院从2004年10月到2005年5月间住院接受手术治疗的声带息肉10例，留取手术切除的标本。取标本的过程不影响手术的术式和范围。男7例，女3例；年龄24～55岁，中位数40.5岁。另外，取3例因下咽癌行喉全切除病例，取其声带作为正常声带对照，肿瘤组织距正常声带1 cm以上。3例对照均为男性，年龄为48～68岁，中位数65岁。
　　上述病例中进行透射电镜观察标本6例次，其中声带息肉4例（男2例，女2例），正常声带2例；进行扫描电镜观察9例次，其中声带息肉7例（男5例，女2例），正常声带2例，有2例标本既进行透射电镜观察，又进行了扫描电镜观察。
　　二、实验方法
　　1、透射电镜样品制备和观察：手术切除的标本立即放入2％戊二醛固定液中固定4 h以上。0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗，15 min×3次。1％锇酸4℃后固定2 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗 15 min×3次。乙醇梯度脱水。环氧树脂Epson812包埋。60 ℃烤箱聚合。制备半薄切片。在光镜下观察半薄切片，选取上皮层和固有层完整的部位常规方法制备超薄切片。载膜铜网捞片，醋酸双氧铀溶液和柠檬酸铅溶液双重染色。透射电镜观察（JEOL  JEM-1230型），加速电压为75 kV，放大倍数为6 000～30 000倍，拍照。
　　2、扫描电镜标本的制备和观察：手术切除的标本立即放入2％戊二醛固定液中固定4 h以上。进行组织消化将每例固定好的标本以薄刀片切为两份，分别观察胶原纤维和弹性纤维。观察胶原纤维，标本用10％NaOH水溶液，20～25 ℃消化5 d；观察弹性纤维，标本用90％甲酸，45℃消化96 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤1 d以上。2％单宁酸处理2～3 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤1 h以上。1％锇酸后固定2h。系列乙醇脱水。醋酸异戊酯处理40min。临界点干燥（HITACHI  HCP-2 型临界点干燥机，日立公司，日本）。镀铂金（HITACHI  E102 型离子溅射仪）JEOL JSM-35C型扫描电镜观察，加速电压为25 kV，放大倍数为200～50 000倍，拍照。
　　结    果
　　一、正常声带和声带息肉的透射电镜观察
　　1、 正常声带的上皮层：声带为复层鳞状上皮。分为角化层、颗粒层、棘层和基底层。角化细胞扁平状，胞核和细胞器退化，消失。角化细胞各层之间连接较紧密，上下相邻的细胞由细胞质伸出许多伪足样突起互相交错镶嵌，形成镶嵌连接，有些细胞之间镶嵌连接很密集，形成“拉链状”结构。棘层细胞呈多边形，胞核居中，呈椭圆形，细胞表面有许多胞质突起，相邻细胞突起互相接触，形成桥粒连接，突起间有明显的细胞间隙。基底细胞胞质较少，与棘层细胞之间间隙较大；相邻细胞间可见桥粒连接。基底细胞与固有层之间未见明显的基底膜和半桥粒连接。上皮细胞各层由浅入深细胞间隙有增大的趋势。
　　2、 正常声带的固有层：固有层内弹性纤维着色均匀，片状无定形物质，形态不规则，可以呈带状、肾形、分叶状，散布在成束的胶原纤维之间，其内可见点状的微纤维横切面（图1a）。固有浅层弹性纤维很少见，固有中层数量增多。固有层见大量的胶原纤维，有各种走向，纵切面见平行的微纤维束状排列，有些弯曲呈弧形，横切面微纤维呈点状（图1b）。从浅层至深层，胶原纤维的数量逐渐增多。在靠近基底细胞处的固有浅层，还可以看到细、短呈网状交织的纤维，但中层和深层不存在。在固有层还可以看到数量不多的散在的成纤维细胞。胞体呈梭形，胞核呈卵圆形，位于一端，核内染色质均匀分布，密集于核膜下，可见核孔。细胞质内见溶酶体和散在的核糖体，高尔基复合体、内质网及线粒体（图1c）。
　　3、声带息肉的上皮层：声带息肉上皮层细胞有两种表现，增厚和变薄，一些病例存在上皮细胞角化层增厚，在同一例患者中，可以同时存在着上皮增厚和变薄这两种变化。细胞间桥粒连接丰富（图2a）。
　　4、声带息肉的固有层：声带息肉上皮基底膜增厚，基底膜区可见较密集的胶原纤维(图2b)。固有层可见炎性细胞浸润，包括粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等。固有层内血管数量明显增多，病变中血管分布在整个固有层，血管扩张、管腔大，有些血管内见大量红细胞，血管内皮细胞变薄，内皮细胞间隙增宽。声带息肉固有层的一个显著特点是成纤维细胞数量增多，细胞器丰富，可见大量内质网、高尔基复合体、线粒体，表明成纤维细胞处于功能活跃状态。声带息肉是发生于固有层的病变，成纤维细胞是合成固有层细胞外基质的主要细胞，其功能活跃提示声带息肉细胞外基质代谢活跃(图2c)。
　　二、正常声带和声带息肉的扫描电镜观察
　　1、正常声带的胶原纤维：经过10％NaOH消化6～7 d后，声带组织中的细胞成分和弹性纤维基本被消化，在扫描电镜下观察，可以看到上皮层的轮廓和固有层部分血管的轮廓。在正常声带中，胶原纤维是大量、密集的，呈粗细不等的束状，每束由平行排列的细纤维组成，纤维束迂曲，纤维束之间并不平行，而是交织向各个方向(图3a)。在胶原纤维束之间，有细的不成束的纤维交织成网络。在紧邻上皮层处，见不成束的迂曲盘绕的胶原纤维，可能是构成基底膜的纤维。
　　2、 声带息肉的胶原纤维：由于声带息肉发生于声带固有层浅层，而胶原纤维主要位于固有层深层，因而在病变组织中观察到的胶原纤维较少。可以观察到，在声带息肉中，胶原纤维束的排列较为紊乱，胶原纤维束中的原纤维失去平行规则的排列，而是相互缠绕。胶原纤维束中有较大缝隙(图3b)。有些胶原纤维束直径较粗大，约10μm。我们还观察到，病变组织中，胶原纤维束纵向呈结节状结构（图3c），这种结构出现的原因尚不清楚。
　　3、正常声带的弹性纤维：经过90％甲酸45℃消化3～4 d后，声带组织中的细胞成分和胶原纤维基本被消化，在扫描电镜下观察，可以分辨出上皮层、固有层和肌层，但固有层的层次分辨不清。在正常声带中，弹性纤维是大量、密集的，和胶原纤维明显不同的是，弹性纤维不成束，纤维的直径不等。弹性纤维卷曲状，呈“弹簧样”外观，迂曲盘绕，但总体上走形向着同一方向。纤维之间有不规则的空隙（图4a）。
　　4、声带息肉的弹性纤维：由于弹性纤维主要位于固有层中层，声带息肉中弹性纤维稀疏、散在分布，数量明显减少。并且，弹性纤维的直径明显变小，纤维纤细，交织成网，走形紊乱(图4b)。
　　正常声带透射电镜观察    a：固有层弹性纤维 ×12 000；b：固有层胶原纤维 ×20 000；c：固有层成纤维细胞  ×10 000    图2  声带息肉透射电镜观察    a：上皮细胞桥粒连接丰富 ×2 500；b：基底膜增厚×6 000；c：成纤维细胞细胞器丰富×12 000    图3  胶原纤维扫描电镜观察    a：正常声带大量密集胶原纤维；b：声带息肉胶原纤维间空隙较大；c：声带息肉胶原纤维纵向结节状    图4  弹性纤维扫描电镜观察    a：正常声带弹性纤维卷曲，密集；b：声带息肉弹性纤维排列紊乱
　　讨    论
　　声带息肉是发生于声带固有层的良性疾病，也是最常见的发声障碍疾病。有许多学者对声带息肉进行组织病理学分型，然而分型方法多样，并不统一。姜捷等[1]将声带息肉分为水肿型、血管扩张型、玻璃样变型和纤维型，陈玄珠等[2]分为血栓型、水肿型、纤维型、混合型和肉芽型，李进让等[3]分为水肿型、血管扩张型、出血型和出血血栓型、纤维型和玻璃样变性型。这些分型与发病机制、复发率、声嘶程度和疾病转归之间关联并不紧密。对声带息肉分型主要依据固有层的病理变化。根据发声的体-被理论(cover-body  theory)，声带分为被层（cover，包括上皮、固有浅层），过渡层（transition，固有中层和深层），体层(body，肌层)，被层在相对固定的体层上运动[4]。被层柔顺而有弹性，没有肌性收缩，体层相对僵硬，能通过主动收缩调节僵硬度，正是由于两层之间在物理机械特性上的差异，才能使声带连续和有控制地振动。根据构成固有层分为三层：浅层含有很少的胶原和弹性蛋白，中层含有较多的弹性纤维和一些胶原纤维，深层含丰富的胶原纤维和一些弹性纤维。除纤维蛋白外，固有层中还有多种糖蛋白和蛋白聚糖。声带的分层结构是黏膜波产生的物质基础，而固有层对发声有至关重要的作用，研究其组织学构成对于理解发声功能尤为重要，也是研究嗓音病理学和病理生理学的基础。
　　声带息肉的确切病因尚不清楚。然而，多数学者认为长期的用声不当或用声过度所致的发声损伤在发病中起重要作用。声带受到发声的慢性损伤，固有层细胞外基质成分生成和降解的平衡被打破，导致细胞外基质成分含量和功能的变化，从而改变了声带振动的机械特性，导致发声障碍。
　　在透射电镜中，我们注意到声带息肉固有层中成纤维细胞数量增多，成纤维细胞的细胞器丰富，作为产生固有层细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要细胞，成纤维细胞的增生及激活，提示病理情况下，ECM的代谢处于活跃状态。有研究表明，暴露于机械压力下的成纤维细胞和没有暴露于机械力的细胞相比，生成ECM成分的水平不同[5]。由于成纤维细胞产生细胞外基质蛋白，有学者尝试通过移植培养的成纤维细胞治疗声带瘢痕等声带疾病[6]。这种尝试给人以希望，然而，这种方法是否能用于治疗，还需要深入研究。
　　在透射电镜中，我们发现病变组织中有炎性细胞浸润。炎性细胞与声带息肉发生有关，然而，这是声带损伤的原因还是结果尚不清楚，炎性细胞在声带息肉发病中的作用尚待研究。
　　声带固有层两种主要纤维蛋白：胶原纤维和弹性纤维，对正常的发声功能起重要作用。胶原纤维构成ECM支架，维持声带形态，并维持组织张力和振动体的均匀性。声带的弹性纤维可以伸展到自身长度的2倍，提供组织弹性，使声带组织受力变形后能迅速恢复原状[7]。由于两者的共同存在，声带能在一定范围内拉伸变形，并迅速恢复原有形状，还能抵制外力作用，使声带在快速的振动中不改变其基本形态。环甲肌收缩使声带拉长后，纵向的弹性纤维使声带迅速恢复到松弛状态，并迅速恢复自然声调，这在发声机制中起重要作用。向不同方向卷曲的弹性纤维还可以抵抗来自不同方向的力[8]。胶原和弹性纤维影响声带的生物机械力学。有学者绘制了声韧带压力-应力曲线图，声带长度随着外力增加而变长，在压力达到一定程度之前，这种变化是接近线性的，这主要由弹性纤维的特性决定；当外力达到转折点后，曲线斜率显著上升，外力增加很大而声带长度变化很小，这主要由胶原纤维特性决定[9]。本研究观察到，声带息肉病变中胶原纤维束的排列较为紊乱，胶原纤维束中的原纤维失去平行规则的排列，相互缠绕，胶原纤维束中有较大缝隙；弹性纤维稀少，较正常纤细，交织成网。陈玄珠等[2]用组织化学染色观察40例声带息肉，在所有标本中均有弹性纤维破坏。这种形态上的改变可能是声带息肉造成发声障碍的组织病理学基础。声带息肉形态学改变对生物机械力学的影响尚需进一步研究。
　　在本研究中，我们还观察到病变中出现一些非常粗大的胶原纤维束，纤维束间空隙较大，胶原纤维束呈纵向的结节状结构。Ishii等[10]观察到正常成人胶原纤维表现出结节状分布，认为这种改变可以阻止黏膜波时声带组织背离正常位置，维持层状结构，保持黏膜波稳定，是适应黏膜波速度改变的一种变化。
　　本研究通过透射电镜和扫描电镜探讨声带息肉超微病理学变化，特别是固有层的变化，观察到产生固有层ECM的主要细胞，即成纤维细胞数量增生，功能活跃。ECM的两种主要纤维成分胶原纤维和弹性纤维数量和形态发生变化，这些变化可能导致声带作为振动体的物理特性改变，从而影响了声带的发声功能。