姜卫东 高想 蒋凤荣 ……

心力衰竭(congestive heart failure，心衰)是各种心脏病的严重阶段，严重影响患者的生活质量，危及人类的生命。因此，CHF的防治已成为心血管研究领域重要的课题。近年的研究发现，心肌细胞的反复丢失是心衰进程中最为主要的因素。而心肌细胞凋亡可能是其反复丢失的根源所在。同时因凋亡所致的心肌细胞死亡与病理性的心室重构密切相关。因此，对由于凋亡所致的心肌细胞数量减少的研究，逐渐成为心衰研究的热点。细胞凋亡是一种细胞自主生理性死亡,在多细胞生物体的发育、严重受损细胞的清除及多种细胞增殖性疾病中发挥着重要的作用。近年来,有关细胞凋亡分子机制的研究很多,尤其是Bcl-2家族蛋白和MAPKs信号传导途径,是有关细胞凋亡分子生物学研究的热点。中医学在心力衰竭的长期医疗实践中，积累了不少的经验。因此，在中医中药领域内寻找治疗CHF的有效药物，并从调控凋亡基因、抑制细胞凋亡、逆转心脏重构切入，应是一项很有意义的工作。本研究通过制作心衰大鼠动物模型后，观察以利心冲剂(由黄芪、黄精、补骨脂、葶苈子等组成)对心肌细胞凋亡的影响，并通过对与凋亡相关的Bcl-2家族蛋白和MAPKs信号传导途径变化的检测，探讨利心冲剂对大鼠心肌细胞凋亡的作用机制。南通市中医院心血管内科姜卫东

一　材料与方法

1．1药品与试剂

　　利心冲剂主要由黄芪、黄精、补骨脂、葶苈子等组成，由江苏南通市中医院提供，阿霉素，深圳万乐药业有限公司，批号0505031，卡托普利：25mg／片，由中美上海施贵宝制药公司生产(批号：0505031)。抗体中国武汉博士德公司提供，引物由上海生物工程公司提供。其它化学试剂均为分析醇。

1.2　动物分组及造模  取50只Wistar大鼠适应性喂养7天后，随机取10只(雌雄各半)作为A(空白对照组)。腹腔注射等体积生理盐水，给药容积同盐酸阿霉素。余40只大鼠用阿霉素造模，用药量4mg/Kg，每5天注射一次，共3次。末次ADR给药24小时后，随机选取模型鼠2只，断头处死，取出心脏，用预冷0.9%生理盐水冲洗，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察确认造模成功后，再将所余大鼠随机分为B(心衰模型对照组), C(卡托普利治疗组0.045mg/100 g)、D(利心合剂低剂量治疗组20g/Kg/d)、(利心合剂高剂量治疗组40g/Kg/d)。各组均精饲料喂养，自由饮水。

1.3 给药方法  C,D组造模后次日开始灌胃给药，连续给药21天，

1.4 观察项目及检测方法

1.4.1 症状观察  观察大鼠活动度、呼吸、发给程度、毛发光泽、水肿、死亡等，隔日称体重并记录。

1.4.2 BCl-2检测    表达:内参beta-actin、BNP引物经Primer 5．0设计。上游引物：5'-TGGGCAGAAGATAGACCGGA-3'，下游引物：5'-ACAACCTCAGCCCGTCACAG-3'；Bcl-2上游引物：5-AGCGTCTTCAGAGACTGCCAG-3，下游引物：5-CACCCCTGGCATCTTCTCCTT-3；beta-actin上游引物：5-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3，下游引物：5-TTCATCTTCATGGTGCTAGGA-3。一步法合成cDNA，Real-time PCR应体系均为15ul，其中含cDNA模板2.5 ul，SYBR Green 7.5ul，引物 0.6ul，去离子水4.4 ul，95℃预变性5min，94 ℃45s，56℃45S，72 ℃50s，35个循环；比较Ct法（△△Ct法）分析结果。

1.4.3 免疫组织化学检测MAPK的表达 SABC法。

1.5 统计方法  SSPSIl.0 统计软件对所得结果进行处理，数据用均数±标准差(X士S)表示，组间差异采用单因素方差分析，计量资料用T检验。

结果

2．1心衰大鼠各实验组中BNP的表达加文字说明

2．2心衰大鼠各实验组中Bcl-2的表达加文字说明

2.3心衰大鼠各实验组中MAPK的表达加文字说明

正常组*40：极少量表达　　　　　模型组*40：见大量表达　　　　阳性组*40：一定量表达

低剂量组*40：中等量表达　　　　高剂量组*40：一定量表达

3讨论

近年来，分子心血管病学的研究进展已经证实了细胞凋亡现象存在于心血管系统的许多生理和病理变化中，细胞凋亡在冠心病的发生发展中有着一定的病理意义。研究发现缺血所致的细胞内Ca2+超载氧自由基增多是导致细胞凋亡的主要原因。在动脉粥样硬化、血管成形后再狭窄、心肌梗死和心肌缺血-再灌注损伤等病变中发现细胞凋亡存在。Bcl-2是第一个被发现参与凋亡调控的基因家族，Bcl-2蛋白可抑制细胞凋亡[4]，促凋亡基因Bax与Bcl-2结构类似,与Bcl-2结合,阻止Bcl-2的激活,从而促进凋亡[5]。Misao等研究了Bcl-2基因和Bax基因在急性心肌梗死患者心室肌细胞中的表达作用，认为在心肌缺血和(或)再灌注损伤后Bcl-2的表达和Bax的过度表达对心肌细胞凋亡的保护或促进可能起着一个重要的病理生理作用。

本研究通过阿霉素所致心衰大鼠模型。两组心衰细胞观察均可见典型的细胞凋亡形态,但凋亡指数测定,实验组明显低于对照组;免疫细胞化学染色及蛋白表达定量检测提示,实验组Bcl-2表达增强,而对照组Bax表达增强。由此提示,心衰过程中伴随大量心肌细胞凋亡,葛根素在体内具有拮抗心肌细胞凋亡的作用,通过利心冲剂干预,能上调心肌细胞的Bcl-2表达,同时下调Bax的表达,两种蛋白比例发生明显变化。结合细胞凋亡率检测结果推测，利心冲剂抑制心肌细胞凋亡，可能与其改变凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达有关。

综上所述: 利心冲剂具有抗心衰大鼠心肌细胞凋亡的作用,其作用机制可能与葛根素抑制细胞Ca2+超载、抗氧自由基、干预Bcl-2、Bax蛋白的表达有关。针对葛根素抑制细胞凋亡作用的特点,今后应加强中西药联合用药的研究,为临床治疗心衰提供新的思路。