化疗耐药是导致骨肉瘤治疗失败的主要原因之一,与多种耐药相关基因有关。本研究应用免疫组织化学的方法检测骨肉瘤组织中P-糖蛋白(P-gp)的表达分析其与骨肉瘤预后的关系并同期测定LRP及bcl-2的表达，探讨与P-gp表达的关系。

　　1、材料与方法

　　1.1 临床资料

　　本组男27例，女15例;年龄10~55岁，中位年龄24岁。股骨21例，胫骨12例，肱骨9例。所有病人术前均未行化疗。术式例数：截肢或关节离断术22例，瘤段切除假体置换术11例，扩大切除术8例，肌皮瓣转位术1例。组织学分型按Dahlin’s分型方法进行分类。29例获得了平均1年8个月(6个月~3年9个月)的随访并进行了Enneking分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期15例，Ⅲ期12例。

　　1.2 标本选择

　　所有标本均经病理证实常规固定，石蜡包埋。连续切片，厚5μm，待检。

　　1.3 免疫组化试剂

　　所有免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，Ⅰ抗均为美国Santa Cruz公司产品。染色采用SABC法。用已知肿瘤组织阳性片作阳性对照，用PBS代替Ⅰ抗作阴性对照。

　　1.4 结果的判断

　　P-gp阳性结果主要位于胞浆中，部分位于细胞膜，LRP阳性表达位于胞浆中， bcl-2的阳性产物主要位于胞浆;均以出现棕色颗粒为阳性。每张切片连续计数200个肿瘤细胞，阳性细胞数小于5％为阴性，阳性细胞数大于5％为阳性。

　　1.5 统计学处理用X2检验。

　　2、结果

　　2.1 P-gp在骨肉瘤中的表达

　　本组P-gp阳性15例，阳性表达率为35.7％，P-gp表达与患者的年龄、性别、Dahlin's分型和Enneking分期均无关(P>0.05)，见表1。在随访的29例中，16例为阳性表达，仅有1例预后良好;阴性表达的13例中，9例预后良好，经统计学分析预后不良组的阳性率(77.8％)明显高于预后良好组(18.2％)，见表2。

　　2.2 LRP、bcl-2在骨肉瘤中的表达

　　本组LRP阳性表达率为42.86％，bcl-2阳性表达率52.38％。两者的表达与年龄、性别、Dahlin's分型和Enneking分期均无关，见表1。两者在骨肉瘤中的表达无相关性;LRP、bcl-2的表达与预后密切相关，并且两者在骨肉瘤中的表达呈明显的一致性，见表2。

　　2.3 P-gp表达与LRP、bcl-2表达之间的关系。

　　P-gp和LRP同时呈阳性表达13例，P-gp和bcl-2同时呈阳性表达14例，三者同时阳性表达者4例;P-gp和LRP之间具有相关性;而P-gp和bcl-2之间没有相关性，见表2。

　　3、讨 论

　　P-gp是多药耐药基因(MDR)编码的蛋白质，它在多种人类恶性肿瘤中均有高表达。目前有关骨肉瘤中P-gp表达的研究尚有分岐。Hornicek等用免疫荧光的方法对40例骨肉瘤患者进行了研究，结果显示P-gp的表达能预测ⅡB骨肉瘤患者的生存时间的长短。Serra[2]等也指出P-gp蛋白水平的增高、肿瘤体积>150ml、年龄<12岁，均为复发的高危险因素。

　　于秀淳等[3]用免疫组化的的方法检测了33例骨肉瘤中P-gp的表达，结果阳性表达率为45.5％，证实P-gp的表达是骨肉瘤产生耐药的重要因素，并影响患者的预后，但P-gp的表达与骨肉瘤的临床因素间无明显相关性。本组应用免疫组化的方法，结果发现42例骨肉瘤中，15例P-gp阳性表达，阳性表达率为(35.71％)，并且P-gp的表达患者的预后有关，这与上述结果相似。

　　另有研究表明P-gp的表达不能作为骨肉瘤耐药的指标。Kumta等对45例骨肉瘤患者进行了平均14个月的随访研究，结果示P-gp的表达与化疗后的肿瘤坏死率无关。Pakos等的研究表明P-gp的表达与联合化疗后的肿瘤组织学变化无关。这说明MDR影响骨肉瘤预后的原因不单纯是由于肿瘤细胞产生耐药引起的，尚存在其他机制。

　　关于骨肉瘤中P-gp表达与LRP、bcl-2的相关性研究，目前尚报道很少。刘国艳等的研究中发现P-gp与LRP在卵巢癌中的表达无相关性，本研究发现LRP与P-gp表达具有相关性，表明LRP在骨肉瘤中具有介导多药耐药的作用。

　　bcl-2是一种凋亡抑制基因，研究证明，在恶性骨肿瘤复发后P-gp、bcl-2的表达均有增强的趋势。本研究中，bcl-2蛋白和P-gp蛋白的表达无明显相关性。此外P-gp LRP、bcl-2同时表达阳性者共4例，占13.8％，P-gp和LRP同时呈阳性表达13例，占44.9％，P-gp和bcl-2同时呈阳性表达14例，占48.3％。表明骨肉瘤的耐药及预后与多种基因的异常表达有关，它们有的联合发挥作用，有的独立起作用。

　　应用免疫组化检测肿瘤细胞中耐药性相关蛋白简便、客观、经济，可应用临床预测化疗的敏感性和判断患者的预后。