TLR9在胰腺癌中的表达及临床意义

吴汉青朱世凯 张建军 杨智勇 王春友 吴河水*

【摘要】目的  检测TLR9在胰腺癌组织中的表达，探讨其临床意义。方法  采用实时定量PCR法、免疫印迹及免疫组织化学方法检测30例胰腺癌组织及其相近癌旁组织、10例正常胰腺组织中TLR9的表达，并分析胰腺癌组织中TLR9的表达与病理分级、临床分期及转移的关系。结果 胰腺癌TLR9mRNA扩增倍数值为2.32(1. 41~3.22)，癌旁组织为1.23 (1.18~1.28)，两组表达有显著差异(t=2.642, P=0.023)。胰腺癌TLR9蛋白阳性表达率为73.3%，癌旁组织为33.3%，正常胰腺组织为20%，呈递减趋势(c2 =13.99, P=0.001)。胰腺癌TLR9高表达和肿瘤分化成度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关。Western blot结果与免疫组织化学一致，灰度分析结果显示差异显著。 结论  TLR9在胰腺癌组织中高表达,且TLR9表达与肿瘤分级有关 ,提示可能通过免疫机制参与胰腺癌的发生、发展过程。武汉协和医院急诊科吴汉青

【关键词】胰腺肿瘤，癌，TLR9

TLR9 expression in pancreatic cancer and its clinic significance

Han-Qing Wu, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Zhi-Yong Yang, Chun-You Wang, He-Shui Wu

Department of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China

Correspondence to: Professor He-Shui Wu, Email:heshuiwu@163.com.

[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore their clinical significance. Methods: The real-time RT-PCR technique, western blot method and immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 in the pancreatic cancer, tissues near tumor, and normal pancreatic tissues which obtained during operation from 30 pancreatic carcinoma patients and 10 normal non-lump patient. The relationships with pathological grade, clinical stage, and metastasis of pancreatic cancer were statistically analyzed. Results The amplification value level of TLR9mRNA expression in human pancreatic tissues, paracancerous tissues were 2.32（1.41~3.22）and 1.23（1.18~1.28），respectively（t=2.642,p=0.023）.The percentage of positive cells expressed TLR9 protein in human pancreatic tissues, paracancerous tissues and normal tissues were 73.3%, 33.3% and 20.0%,the protein expression level of TLR9 was gradually descending(c2=13.99,P=0.001). The highly expressed TLR9 correlated significantly with the degree of tumor differentiation、an advanced TNM stage and lymph node metastasis. Similar result was obtained by Western blot.Conclusions: TLR9 has a higher expression in pancreatic cancer tissues. TLR9 expression has a close relationship with pathological grades of pancreatic cancer, suggesting that TLR9 play an important role in the development and progression of pancreatic cancer through immunologic mechanism.

[Key Words] Pancreatic neoplasms; Cancer; Toll-like receptor 9

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一新发现的古老的受体家族，不仅是参与天然免疫的重要受体，而且与特异性免疫、免疫耐受和某些疾病防治密切相关。近来发现toll样受体可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[1]。而TLR9为该家族重要成员，能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶的表达[2]。很多肿瘤都出现TLR9高表达现象，但TLR9是否与胰腺癌的发生，发展有关，目前尚不清楚。本研究旨在通过观察胰腺癌中TLR9的表达情况，探讨其与胰腺癌发生发展的关系，并探讨其临床意义，以期为胰腺癌的治疗提供新的依据。

资料与方法

一 、临床病理学资料

30例人新鲜胰腺癌组织及相应的癌旁组织（据肿瘤边缘1-2cm）取自胰腺癌患者、10例正常胰腺组织标本取自其他原因需行胰腺部分切除的非肿瘤患者，所有标本均为华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心2008年12月至2009年8月接受手术治疗的胰腺癌患者且经术后病理证实，术前未行放疗及化疗。标本均在手术切除后立即采集，一式两份，一份立即放入液氮中，然后置于-80℃保存备用。另一份用10%甲醛固定后用石蜡包埋，用以免疫组织化学分析。40例患者中男性19例，女性11例，年龄39～75岁，平均年龄57岁。肿瘤组织病理分级：高分化12例，中低分化18例。 淋巴结转移10例，未转移20例。

二、实时定量PCR检测TLR9基因表达情况

三、免疫印记检测TLR9蛋白表达情况

常规方法进行组织蛋白提取，考马斯亮蓝法测蛋白浓度。取15μl蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉封闭非特异性抗原，加入1：750稀释的兔抗人TLR9单克隆抗体(cell signaling公司)，4℃孵育过夜，用含0.1％Tween20的TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入增强化学发光底物EcL Plus试剂，曝光于x胶片上，曝光时间为30 s，常规显影，定影。采用自动电泳凝胶成像分析软件(Band scan v5.0)进行图像扫描和分析。

四、免疫组织化学检测TLR9蛋白表达情况

采用免疫组织化学SP(streptavidin-perosidase)法，参照免疫组织化学试剂盒(武汉博士德公司)说明书进行。以已知TLR9阳性的肺癌组织[3]切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察细胞染成棕黄色者为阳性，着色物质呈颗粒状或片状，主要存在于肿瘤细胞胞浆内。染色结果通过双盲评价，随机观察10个高倍视野，避开肿瘤边缘及坏死区域，根据显色强度和着色百分数进行半定量分析，依细胞阳性着色程度分为：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。依着色阳性百分比分为：未染色为0分，阳性细胞总数<25%为1分，阳性细胞在25%-49%为2分，阳性细胞总数在50%以上为3分。将两个分值相加，0～1分为阴性（C），2～3分弱阳性（），4～5分为阳性（），5分以上为强阳性（）。（）与（）为高表达，（C）与（）为低表达。

五、统计学方法　

采用 SPSS 13.0 统计分析软件，应用t检验、χ2检验、 Fisher 精确概率法及秩和检验作数值间的差异和相关性分析。以α=0. 05为检验水准，P<0.05为差异有统计学差异。

结 果

1 实时定量PCR结果

正常胰腺组织、胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中均有TLR9mRNA和β-actin mRNA的表达。以正常胰腺组织中TLR9mRNA作为对照，胰腺癌TLR9mRNA的扩增倍数值为2.32（1.41~3.22）,癌旁组织为1.23（1.18~1.28），两组表达差异显著（t=2.642，p=0.023）。

2免疫印迹结果

由图1可见，癌及癌旁组织以及正常胰腺组织内均有内参GAPDH蛋白的表达，蛋白条带位置为36 kDa，TLR-9的表达位置在130 kDa。TLR9在癌组织中的表达量明显高于相应的癌旁组织及胰腺正常组织。

图1 TLR-9蛋白质免疫印迹结果（1：正常胰腺，2：癌旁胰腺组织，3胰腺癌组织）

3免疫组化结果

TLR9蛋白主要表达于癌细胞的胞浆内，呈棕黄色或棕褐色，染色均一；癌旁组织及正常胰腺组织的胞浆中也可见到TLR9蛋白表达，但呈浅黄色且较胰腺癌组织少(图2)。TLR9在正常胰腺组织、胰腺癌旁组织和胰腺癌组织中的阳性表达率分别为20％(2/10)、33.3％(10/30)和73.3％(22/30)，各组之间差异有显著性统计学意义(χ2=13.99，P=0.001)（表1）。正常胰腺组织中TLR9未见高表达，而胰腺癌组织中TLR9蛋白高表达占73.3％(22/30)。从正常组织、癌旁组织到胰腺癌组织，TLR9的阳性表达率呈递增趋势。30例胰腺癌癌组织中TLR9蛋白的高表达与肿瘤的部位以及肿瘤大小无关(P>0.05)，而与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05，表2)。

图2 TLR9蛋白在胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常胰腺组织中的表达（×200）；胰腺癌组织（A），癌旁胰腺组织（B），正常胰腺组织（C）

表1 TLR9蛋白正常、癌旁和胰腺癌组织中的表达情况

组别

例数

TLR9蛋白阳性

阳性率（%）

阳性

阴性

正常组织

癌旁组织

胰腺癌组织

10

30

30

2

20

22

8

10

8

20.0

33.3

73.3

表2  胰腺癌组织中TLR9高表达与病理参数的关系

临床特征

例数

TLR9高表达阳性

TLR9高表达阴性

阳性率（%）

P值

肿瘤部位

  胰头部

  胰体尾部

20

10

15

7

5

3

75.0%

70.0%

1.00

肿瘤大小

   ≤3cm

   >3cm

17

13

13

9

4

4

76.5%

69.2%

0.68

分化程度

   高分化

 中低分化

12

18

6

16

6

2

50.0%

88.9%

0.034

TNM分期

    І CП

    Ш-

13

16

7

15

6

1

53.8%

93.8%

0.026

淋巴结转移

    无

    有

20

10

13

9

7

1

65.0%

90.0%

0.024

注：应用χ2检验、Fisher精确概率法进行统计学分析

讨 论

    TLRs是新近发现的病原模式识别受体，能够识别特定类型微生物的保守分子成分，即病原体相关分子模式(pathogen―associated molecular patterns，PAMPs)。1997年Medzhitov[4]等首次发现了人类的第一种Toll同源变体(即TLR4)，后又发现并确认了10种人的TLR家族蛋白，分别被命名为TLR1-TLR11。其中TLR9是TLR家族的重要成员，其特异性识别的PAMPS为细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脱氧核苷酸(CpG―oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)[5]，TLR9在介导外源CpG DNA激活先天免疫过程中有重要的生物学意义。TLR9除了抗感染作用,还与自身免疫紊乱、恶性肿瘤的发生相关[6]。有研究表明，由TLRs包括TLR9诱导的信号通路可能在肿瘤形成过程中起着重要作用，TLRs表达的上调与胃癌、肠癌、肺癌等发生、发展可能有密切关系[7]。同时研究还发现TLR9在肿瘤上的表达可为肿瘤的化疗、免疫治疗提供新方法。但目前对于TLR9在胰腺癌中的表达及作用了解甚少。

本研究对胰腺癌肿瘤组织内的TLR9在基因水平和蛋白水平以及TLR9蛋白大小都作了检测，并和癌旁胰腺组织及正常胰腺组织进行对比，在基因水平上结果发现胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常组织中均有TLR9mRNA的表达，但癌组织的表达最高，显著高于非癌组织(P<0.05)。在免疫组化染色图片上，发现TLR9主要在胰腺癌的胞浆细胞中表达，并且胰腺癌组织中TLR9阳性表达率明显高于胰腺癌旁组织和正常胰腺组织，这与Droemann[3]在肺癌中的研究呈正相关结果一致。胰腺癌组织中TLR9的高表达与患者的年龄、性别、肿瘤的部位以及大小无关，而与肿瘤分化程度、TMN分期、淋巴结转移或远距转移有关，提示TLR9受体不仅参与正常胰腺组织的生长和发育等生理功能，也参与胰腺组织的恶性转化过程。Schmausser[8]等的研究证实TLR9与其他TLRs共同参与胃癌的发生。本研究结果与其一致。

近年大量研究证实，CpG ODN具有很强的Th1方向的免疫凋节作用，主要是通过与TLR9结合，诱导分泌IFN-7、IL-12等Th1极性的细胞因子，促进Th0细胞向Th1方向分化。如CpG DNA通过序列非依赖性受体介导的内吞作用进入树突细胞，在溶酶体区域与TLR9特异性作用，然后通过IRAK1、IRF7、TRAF6、MAPK、核因子-KB(NF-KB)途径及衔接子MyD88激活下游信号通路[9]。通过下游信号通路最终导致类浆细胞树突细胞的活化并成熟为专职抗原提呈细胞。这些成熟的抗原提呈细胞表面表达共刺激分子(CD80、CD86)、趋化因子受体CCR7，分泌Th1型细胞因子，活化NK细胞[10]，由于中性粒细胞表面Fc受体表达的增加，细胞毒活性增强，从而进一步引起更多类浆细胞、树突细胞活化成熟、抗原提呈。通过CpG与TLR9的作用，抗原提呈细胞如Dc细胞可以交叉提呈外源性抗原，从而交叉激活CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞的活化，产生Th1型的免疫反应，激活天然免疫反应[11]。而目前CpG ODN作为免疫佐剂通过TLR-9诱导强的Thl型免疫应答在人肺腺癌A549细胞上，可能作为单一治疗或者免疫治疗的辅助治疗应用于肿瘤的治疗[12]。

综上所述，TLR9在胰腺癌组织中的高表达提示其有可能成为肿瘤治疗的一个新的干预靶点。TLR9蛋白的表达与胰腺癌细胞的恶性程度有关，亦与胰腺癌是否有淋巴结转移有关，这为胰腺癌的治疗及预后判断提供了参考依据。运用 TLR9的相关配体CpG ODN对胰腺癌进行免疫治疗可能为胰腺癌治疗提供了新的治疗可能。

参考文献

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3.      Droemann D, Albrecht D, Gerdes J ,et al. Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9[J]. Respir Res,2005,6(1):1-10.

4.      Medzhitov R, Preston - Hurlburt P, Janeway CA. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature, 1997, 388: 394C397.

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8.      Schmauber B，Andrulis M，Endrich S, et al. Toll-like receptors TLR4, TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells: An implication for interaction with Helicobacter pylori[J]. Med Microbio, 2005,295(3):179-185.

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10.  Ballas Z. Modulation of NK cell activity by CpG oligodeoxynucleotides[J]. Immunol Res,2007;39(1-3):15-21.

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12.  Krieg AM. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer[J]. Oncogene, 2008; 27:161-167.

本课题受国家自然科学基金资助（基金编号：30200272）

作者简介：吴汉青，男， 在读博士，主要从事胰腺肿瘤方面的研究。E-mail:wuhanqincat@163.com

通讯作者：吴河水，教授，博士生导师，武汉 430022，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心；Email:heshuiwu@163.com.