吴汉青 王博 朱世凯 张建军 王春友 吴河水*

【摘要】目的 检测TLR9在人胰腺癌及胰腺癌细胞中的表达，研究CPG ODN2216对Panc-1细胞生物学行为的影响，并探讨其临床意义。方法 通过免疫组织化学方法确认TLR9蛋白在胰腺癌组织中的高表达，免疫荧光确认其在胰腺癌细胞株Panc-1中的高表达。通过细胞粘附、划痕实验、侵袭实验、细胞克隆及MTT增值实验，研究CPG ODN2216对细胞粘附力、活动力及增殖力的影响。结果 人胰腺癌标本及人胰腺癌细胞株Panc-1均高表达TLR9。划痕实验、体外粘附实验、基质胶侵袭实验、细胞克隆实验证明CPG ODN2216实验组细胞粘附力及活动力明显低于未加序列对照组。MTT法检测序列组增殖力明显低于未加序列对照组，且增值活性具有时间剂量依赖性。结论TLR9基因与人类胰腺癌的侵袭转移潜能相关，外源配体CPG ODN2216的使用可明显抑制人类胰腺癌细胞Panc-1的侵袭、迁移能力。武汉协和医院急诊科吴汉青

【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学

Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancer

Han-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui Wu

Department of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China

Correspondence to: Professor He-Shui Wu, Email:heshuiwu@163.com.

[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vitro cell adhesion, Wound-healing scrape assay, transwell invasion assay and cell colony formation assay were performed to assess the effect of CPG ODN2216 on the invasive properties of Panc-1 cells. Results: The TLR9 were high expressed in the pancreatic cancer tissue and pancreatic carcinoma cells. In vitro experiments as cell spreading assays、cell adhesion、colony formation assay and invasion assays showed the cell adhesion and cell motility properties of CPG ODN 2216 group were apparently weakened compared with the

Control group. The MTT assay showed cell proliferation ability in the CPG ODN group was notably decrease, and CPG ODN2216 had inhibitive effects on growth of panc-1 cells in a dose and time-dependent manner.Conclusions:TLR9 gene is correlated with the invasive and metastatic potential of pancreatic carcinoma, and used of CPG ODN2216 induces the inhibition of migration and invasion of Panc-1 cell line.

 [Key Words] CPG ODN2216; Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9;Oncogenesis

近来发现toll样受体可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程[1]。而TLR9为该家族重要成员，能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶的表达[2]。很多肿瘤都出现TLR9高表达现象，为了研究TLR9基因在胰腺癌发生过程中所起的作用，在证实其在胰腺癌中高表达后，我们采用TLR9的特异性配体人工合成的寡脱氧核甘酸2216（CPG ODN2216）刺激胰腺癌细胞Panc-1,观察胰腺癌细胞的生长增殖、成瘤能力和侵袭能力等恶性表性方面的变化，验证TLR9基因在胰腺癌细胞发生和生长中所起的作用，为进一步研究TLR9基因的具体作用机制提供信息。

1.                 材料与方法

一、 实验材料

二、 实验方法

1.       免疫细胞荧光化学：用胰酶消化胰腺癌Panc-1细胞制成单细胞悬液，将单细胞悬液滴到玻片上。根据细胞生长状态，24小时或更长时间适时取出爬片。PBS漂洗三次，每次5min，用4%的多聚甲醛固定15min；PBS漂洗三次，用0.5%Triton穿孔20min；PBS漂洗三次，用5%BSA封闭30min；甩干液体后，直接加入稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗。于4℃孵育过夜；PBS漂洗三次，加入稀释的二抗，于37℃孵育1h；PBS漂洗三次，加入稀释的SABC-FITC，于37℃孵育30min；PBS漂洗三次，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。

2.       免疫组织化学：石蜡切片脱蜡后，酒精水化。3％过氧化氢室温下浸泡10 min。切片在0.01moL枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中抗原修复。用5％山羊血清BSA室温封闭30 min，弃封闭液。加入适当稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗，4℃过夜。PBS漂洗3遍，每遍5min；加生物素标记的二抗室温孵育30 min，PBS洗3遍；加入SABC，室温孵育30min。PBS清洗后DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察结果。

3.       二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测胰腺癌细胞的增殖：将消化的胰腺癌细胞悬液按1×103/孔接种于96孔培养板中，每孔100μl。37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，24h细胞贴壁后，用不同浓度(0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的CPG ODN2216作用细胞Panc-1,分别于培养后24h、48h、72h，加入浓度为5mg/ml的MTT20μl；培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜，150μl/孔，震动混匀，用酶标仪，在波长490nm处测定A值。抑制率=(A对照组-A药物组)/A对照组×100％[3]。绘增殖抑制曲线，测半数抑制浓度(IC50)。

4.       划痕实验：将细胞浓度2×105/ml的Panc-1细胞悬液按每孔3ml加入6孔板，培养24h或更长时间，细胞生长达80％满后，弃培养液，加入浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216的培养液，继续培养24h。弃上清，采用细胞刮刀在孔中央对细胞作一划痕，沿划痕边缘等距离间隔作4个标记作为数据测定点，测量时取平均值。PBS轻洗；加浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216培养液继续培养，每6小时观察1次，测量各个时间点的划痕两侧细胞间的距离。

5.       细胞黏附实验：96孔板铺胶，风干，BSA封阻，孵育60 min；将对照组及实验组(CPG ODN 1μg/ml、10μg/ml两种浓度干扰24 h)细胞浓度调整为(5×105)/ml，接种200μL/孔，孵育1h，PBS洗涤，加入浓度为5mg/ml MTT，培养4h；弃培养液，DMSO溶解20min；在波长490nm处测定A值；细胞黏附抑制率(％)=(A对照组-A药物组)/A对照组×100％。每组细胞设三个副孔，取平均值。

6.       细胞侵袭实验：在Transwell上室膜上室侧加入30μL人工基底膜胶并风干，分别加入200μL（含1×105个细胞）饥饿培养24h的细胞，调整CPG ODN的浓度为1μg/ml、10μg/ml。在侵袭小室下室加500μL含10%FBS作为趋化因子的DMEM培养基，置37℃、5%CO2中培养。24h后取出小室，用棉签擦去上室中未转移的细胞和多余液体。将小室用4%多聚甲醛中固定10min，然后用1%结晶紫染色30min。去离子水充分洗膜。显微镜下观察并计数。每组细胞设三个副孔，取平均值。

7.       细胞克隆实验：用胰酶消化Panc-1细胞，吹打制成单细胞悬液，接种于6孔板，约200个/孔，设为不加CPG组和浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG组，每组细胞设2个复孔。将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14 d。肉眼见到可见细胞克隆体后终止培养，去除培养液，PBS洗涤，苏木素染色30 min，PBS洗涤，计数细胞克隆形成率，数码照相照相。实验重复3次。

8.       统计学分析：实验数据经SPSS13.0软件分析，所有数据用平均数±标准差表示，对各组实验数据之间差异是否有统计学意义进行t检验，P