广州中医药大学附属第二医院，广东省中医院胃肠外科

[摘要] 目的：首次通过实验探讨丝分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信号通路MEK5基因启动子区多态性与中国华南地区散发性结直肠癌（colorectal cancer CRC）易感性的关系。方法：采用病例对照法，收集华南地区737例散发性结直肠癌患者及703例健康人血液DNA，利用TaqMan-MBG荧光探针法分析分析MEK5基因启动子区多态性。应用western blot方法对阳性位点进行蛋白表达研究。结果：MEK5163T>C位点以野生纯合子 TT分布为参照，纯合突变子CC罹患散发性结直肠癌风险降低0.57倍(优势比OR= 0.43; 95% CI = 0.24-0.77; P = 0.003)；以T等位基因作为参照，C等位基因在罹患结直肠癌的风险上降低0.21(优势比OR= 0.79; 95% CI = 0.61-0.94; P = 0.011)。另外，该基因启动子区的-118C>T和-163T>C多态性位点与环境因素如吸烟、喝酒和肥胖在结直肠癌的发病上存在一定的交互作用。而-1118C>T位点各基因型在CRC 组与健康对照组分布无统计学差异（P >0.05）。Western blot 结果显示在结直肠癌肿瘤组织中，MEK5蛋白水平在携带-163CC基因型的个体中（n = 1; F= 0.36) 低于携带-163TT基因型个体中（n = 3; mean ± SD = 1.12 ± 0.15) 和携带-163TC基因型个体（n = 3; mean ± SD = 1.01 ± 0.11) （P<0.05)。结论：MEK5基因启动子区-163变异纯合型CC是中国南方人群散发性结直肠癌发病的独立保护因素，其变异基因型TC/CC在吸烟人群中对散发性结直肠癌的发病也有一定的保护作用。MEK5 -163CC变异基因型可能是通过下调MEK5蛋白的表达从而起到抑癌的功能。广东省中医院胃肠外科刁德昌

[关键词]  MEK5基因；单核苷酸多态性；结直肠癌；

人类基因组DNA测序和分析工作的完成，为系统研究基因功能以及相关遗传疾病提供了有力的依据。SNP（单核苷酸多态性）是第三代遗传标记，在遗传性疾病等研究方面日益受到重视，阐明其意义将有助于了解人类基因的功能，遗传相关疾病的病因诊断和防治有着重要意义。结直肠癌是一个涉及多因素、多基因、多阶段的复杂疾病，从基因和环境层面探讨其发生、发展的具体分子机制是对其进行有效预防和治疗的根本所在。MAPK信号通路能将将细胞外各种刺激信号传到细胞核内，通过一系列复杂机制影响细胞基因的转录和表达，从而调控细胞的生长、增殖和凋亡，在肿瘤的形成和进展中其中极其重要的作用。我们的研究显示MEK5-ERK5信号通路的异常激活可能在结直肠癌的发生、发展中起着重要的促进作用。而目前该信号通路关键中间激酶MEK5蛋白表达在人群中的基因遗传学差异尚不清楚。我们推测MEK5基因调控区的SNPs可能会影响MEK5蛋白的表达，从而影响个体的结直肠癌罹患风险。

我们应用DNA芯片技术在196例CRC与196例健康对照人群中对MAPK家族的多个关键激酶基因的部分多态位点进行了初步检测和分析，其中MEK5基因共入选了8个位点。结果发现MEK5基因启动子区-1118C>T位点在CRC和对照人群中分布存在差异，统计学分析提示该位点可能与CRC发病存在相关性。但由于DNA芯片是一种高通量的检测技术，存在较高的错辩率，上述结果仍然有待更为准确的实验方法去验证。我们拟用应用准确性更为可靠的TaqMan-MGB荧光探针基因分型法，对MEK5基因启动子区多态性进行了研究，探讨MEK5基因多态性与结直肠癌发病风险的关系，帅选出阳性的位点，研究其对MEK5蛋白表达的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要仪器与试剂  主要仪器：ABI7500实时定量荧光PCR仪（ABI，No. 275004365)；ABI 3730 DNA测序仪（ABI公司）。主要试剂：Taqman Universal PCR Master mix(ABI公司）；Taqman (R) Genotyping Assays(ABI,No186109875)；血液基因组抽提试剂盒（北京天根生化科技公司）；1×TE缓冲液（1mmol/L Tris-Hcl, 1mmol/L EDTA,pH=8.0)；测序引物由上海Invitrogen公司合成；DNA探针由上海GeneCore基因生物科技公司合成；2×GoTaq  MasterMixs (Promega)；PCR引物纯化试剂盒（Promega)。

1.2 病人资料 病例组选自2002年7月-2010年2月在广州6个临床中心就诊的703例结直肠癌患者，均经组织病理学确诊，病例组对象纳入标准包括：华南地区汉族人群，无血缘关系。剔除标准为家族性腺瘤性息肉病和遗传性非息肉性结直肠癌。对照组为同时期同一地区无血缘关系的健康体检人群，均为汉族，共737例，对照组与病例组按年龄（±5岁）和性别上相匹配。该项研究获中山大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2 方法

2.1 基因组DNA提取 按常规蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法提取外周血白细胞基因组DNA，pH 8.0 TE溶解，-20°C保存。部分DNA按照实验要求浓度稀释至10ng/uL,-4°C保存备用。

2.2 多态性位点的选择 首先应用Promoter 2.0 Prediction Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）进行MEK5基因启动子区预测，结果显示该基因最可能的启动子区大概位于-1200bp以内。根据Genbank 单核苷酸多态数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Hapmap、Genebank提供的数据库信息，MEK5基因-1200bp以内SNP位点共18个，按等位基因突变频率>0.05的原则筛选，选定-1118C>T[编号rs7172582]，-304T>C [编号rs3743353]和-163T>C[编号rs3743354]作为我们的研究位点。

表1 两个位点DNA探针及相关引物情况

SNP

Primer (5’-3’)a

Probeb

-1118C>T

TGATGATCCTCTGAACCTGTGACT-F

FAM-TGAATTCTCGCCTTGC

AAGCCATGAATCTGAATGTTCGT-R

VIC- TGAATTCTTGCCTTGC

-163T>C

ACAAGGGAATGGAGGATGAGG-F

FAM- TGCGGGTGCGT TCCTGATCA

TCAGACCCCCGACAGCC-R

VIC- TGCGGGTGCGCTCCTGATCA

a F, forward primer; R, reverse primer.

b allelic changes in the probes are shown in boldface.

2.4   Western blot 从中山大学附属第六医院组织库中收集结直肠癌组织标本48例，分析MEK5基因启动子区-163T>C三种不同基因型与MEK5蛋白表达的关系。由于CRC患者中-163CC基因型的比率仅为2.7%，本组标本为-163CC基因型仅1例。所有肿瘤标本均经过病理证实，术前未经历任何治疗。

3        统计学分析

采用基因计数法计算各多态等位基因频率和基因型频率。以拟合优度χ²检验进行哈迪-温伯格（Hardy-weinberg equilibrium，HWE）平衡检验。病例组和对照组基本信息和基因型分布的比较采用χ²检验。基因多态性与结直肠癌的关联强度采用校正比值比(adjusted odds ratio,OR)及其95 %置信区间(95% confidence interval,CI)进行描述。数据采用非条件Logistic回归模型计算各基因型与结直肠癌风险的相关性。采用相乘模型来判断基因-基因和基因-环境之间是否存在交互作用。全部统计分析均在 SPSS 15.0 和 Microsoft Excel 2007软件中进行。P< 0.05表示差异有统计学意义。

图1 两个SNP位点基因型测序图

SNP位点

野生纯合基因型

杂合基因型

突变纯合基因型

-1118C>T

[rs7172582]

基因型

TT

CT

CC

-163T>C

[rs3743354]

基因型

TT

CT

CC

结果

1  研究对象的一般情况

CRC病例组与对照组比较，年龄、性别和身体质量指数分布、癌症家族史差异无统计学意义（P值分别为0.059、0.446、0.165和0.124）。现在饮酒者、现在吸烟者在病例组的分布频率远高于对照组（P<0.05），见表1。我们将对这些差异进行统计学校正，以避免它们对研究结果产生的干扰。

2 -1118C>T和-163T>C与结直肠癌罹患风险的关系

    -1118C>T和-163T>C两个位点基因型和等位基因在病例组和对照组频数分布特征见表3。对照组两个位点实际的基因型频率都符合哈迪-温伯格平衡((P

值分别为0.932和0.406）。对照组测序结果连锁不平衡分析显示-1118C>T 与-163T>C之间存在较弱的连锁不平衡(D’= 0.630 and r2= 0. 102)，显示每个位点可能对于散发性结直肠癌的效应相互独立。

如表3所示，logistic多因素回归分析显示-163T>C位点以野生纯合子 TT分布为参照，纯合突变子CC罹患散发性结直肠癌风险降低0.57倍(优势比OR= 0.43; 95% CI = 0.24-0.77; P = 0.003)；以T等位基因作为参照，C等位基因在罹患结直肠癌的风险上降低0.21倍(优势比OR= 0.79; 95% CI = 0.61-0.94; P = 0.011)；但其突变杂合子TC以及突变基因型（TC+CC）在CRC 组与健康对照组分布无统计学差异(优势比OR= 0.89和0.82; 95% CI = 0.71-1.13和0.67-1.02; P = 0.302和0.074)。

-1118C>T位点以野生纯合子 CC 为参照，突变杂合子 CT、突变纯合子 TT以及突变基因型（CT+TT）在CRC 组与健康对照组分布无统计学差异（P 值分别为0.106，0.133，0.070），提示该位点多态性与结直肠癌的罹患风险可能无关。

3 -1118C>T和-163T>C 多态性与散发性结直肠癌相关性的分层分析及交互作用分析

由于这两个位点的野生纯合子在人群中的分布频率低，因此我们将含突变型等位基因的基因型进行合并与野生纯合子进行比较，即-1118C>T位点以 CC vs CT +TT，同样-163T>C位点以TT vs TC+CC。我们进一步按年龄、性别、吸烟、饮酒、肿瘤位置、癌症家族史和体重指数分成亚组，在各亚组中分层分析MEK5启动子基因型和散发性结直肠癌的关系以及交互作用（或效应修饰作用）。

3.1 -1118C>T位点的分层分析及交互作用分析 如表4所示，-1118C>T多态性在肥胖人群（BMI≥24）中，病例组突变基因型（CT+TT）的比率较对照组高，虽然未能达到统计学上的显著性意义(OR=1.42，95%CI=0.97-2.08，p=0.055)，但p值已经已经接近于0.05。这提示突变基因型肥胖患者与健康对照比较，可能存在容易罹患结直肠癌的趋势。而-1118C>T多态性CC野生纯合性与突变基因型（CT+TT）的分布在性别、年龄、吸烟、饮酒以及家族史等亚组中无统计学差异（p>0.05）。交互作用分析：通过Logistic回归模型以乘法效应分析该多态性位点突变基因型与性别、年龄、吸烟、饮酒、BMI、肿瘤家族史等暴露因素的交互作用，发现-1118C>T多态性突变基因型与饮酒和肥胖在增加结直肠癌罹患风险上存在交互作用（P interaction =0.001和0.038）。

3.2 -163T>C位点的分层分析及交互作用分析 如表5所示，在吸烟亚组，-163T>C野生型TT和突变基因型（TC+CC）在CRC与健康对照中的分布差异有统计学意义，吸烟者为-163T>C多态性位点突变基因型（TC+CC）时，其罹患散发性结直肠癌的风险较-163T>C野生纯合型降低0.37倍(OR=0.63，95%CI=0.45-0.88，p=0.008)。而-163T>C多态性TT野生纯合性与突变基因型（TC+CC）的分布在性别、年龄、饮酒以、家族史和BMI等亚组中无统计学差异（p>0.05）。交互作用分析：通过Logistic回归模型以乘法效应分析该多态性位点突变基因型与性别、年龄、吸烟、饮酒、BMI、肿瘤家族史等暴露因素的交互作用，发现-163T>C多态性突变基因型与吸烟和饮酒在降低结直肠癌罹患风险上存在交互作用（P interaction =0.006和0.001）。

4 -163T>C多态位点不同基因型对MEK5蛋白表达的影响

本实验共收集了中山大学附属第六医院手术切除的新鲜组织标本48例，对其进行基因分型，结果显示为-163CC纯合突变基因型者仅1例。我们随机抽取3例-163TT基因型、-163TC基因型以及这1例-163CC基因型新鲜直肠癌标本作为研究对象，Western blot 结果显示在结直肠癌肿瘤组织中，MEK5蛋白水平在携带-163CC基因型的个体中（n = 1; F= 0.36) 低于携带-163CC基因型个体中（n = 3; mean ± SD = 1.12 ± 0.15) 和携带-163TC基因型个体（n = 3; mean ± SD = 1.01 ± 0.11) （P<0.05)（见图2）。

图2 MEK5基因-163T>C不同基因型MEK5蛋白表达情况

讨论 

基因调控区单核苷酸多态性为手段的研究策略，探讨基因与肿瘤等多基因疾病的发病基础、基因与药物代谢和敏感性的关系、基因与环境的相互作用等，成为近年来生命科学研究的重要方向。目前，已有不少关于结直肠癌与单核苷酸多态性关系的研究报道，主要涉及与肿瘤的发病、转移复发、放化疗敏感性以及预后等相关的重要基因与抑癌基因。对Survivin[1]、P53[2-3]、c-jun等基因的研究表明，基因功能区单核苷酸多态性与结直肠癌的发病密切相关。近年来，MAPK信号通路在结直肠癌发病中的作用越来越受到学者的重视，MAPK家族中ERK1,2以及p38信号通路在结直肠癌发生、发展中的作用以及基本明确，而研究它们的基因调控机制尤其是从分子遗传学角度探讨引起基因表达差异的机制成为近年来研究的热点。

我们课题组的魏宜胜[4]等研究发现，作为MAPK家族一员，MKK4基因-1304G变异基因型是中国南方散发性结直肠癌患病的独立保护因素，这种保护作用在年龄大于60岁和曾经饮酒者更为明显。-1304T→G变异可以使Nkx-2失去结合位点，上调Mkk4表达。

调节细胞生长、增殖、分裂、分化的信号通路，在恶性肿瘤的发病中起了非常重要的作用。MAPK信号通路通过磷酸化级联反应，将细胞外的信号转导到细胞核内，调节细胞的生长、增值、分裂和分化。研究表明，MAPK信号通路的异常激活与结直肠癌密切相关[5]。MEK5-ERK5信号转导通路是最新的一条MAPK信号通路，张巍巍等[3]研究表明，该信号通路可能参与了结直肠癌的发生与发展，并与结直肠癌的预后密切相关。MEK5是ERK5唯一的上游激酶，即使在MEK5过表达的状态下也不激活MAPK家族其他成员。MEK5有2个不同的亚型：50ku的蛋白 MEK5a和40 ku的蛋白MEK5B。Hui Song等[6]发现，MEK5α在Stat3激活介导乳腺癌变和侵袭过程中起着非常重要的作用，它可能是Stat3的一个调节因子。Ghosh AK 等[7]研究表明，c-myc基因启动子结合蛋白-1（MBP-1）过表达通过下调MEK5α的表达以及上调MEK5β的表达而引起前列腺癌细胞的凋亡。另外，还有研究表明MEK5的异常表达与肝癌、肺癌的发病密切相关[8-9]。然而，到目前为止，MEK5与结直肠癌的相关性尚不清楚。

作为MEK5-ERK5信号通路的一个关键中间激酶，我们的研究结果已经证明，MEK5（主要是MEK5α）表达的升高在结直肠癌的发生中起着非常重要的作用，而且MEK5高表达与较高的肿瘤分期、淋巴结转移以及预后不良呈正相关。那么，导致MEK5表达升高的遗传学基础是什么？MEK5基因启动子区的特定碱基的改变（单核苷酸多态性）是否影响了该基因的表达，从而导致结直肠癌的罹患风险升高？作为MEK5-ERK5信号转导通路的关键中间激酶MEK5，其基因启动子区-163突变纯合型CC是中国南方人群散发性结直肠癌发病的独立保护因素，其突变基因型TC/CC在吸烟人群中对散发性结直肠癌的发病也有一定的保护作用，另外，该基因启动子区的多态性与环境因素如吸烟、喝酒和肥胖在结直肠癌的发病上存在一定的交互作用。基因型蛋白表达研究显示MEK5基因-163CC基因型对结直肠癌的保护作用可能是由于其下调了MEK5蛋白的表达。

为什么MEK5基因-163CC纯合突变基因型能下调MEK5蛋白的表达，而-162CT杂合突变型对MEK5蛋白表达的影响无统计学差异？为解释这个现象，我们以TFSEARCH软件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)对MEK5基因启动子区单核苷酸多态性进行了生物信息学分析。我们发现，HSF能结合-163T，但不能结合-163C。HSF是一种常见的转录因子，在不少恶性肿瘤中起着癌基因的作用，包括前列腺癌[10]、甲状腺癌[11]和结直肠癌[12-13]。有研究表明，在减数分裂受到抑制的情况下，HSF1能直接调节性别相关基因的转录活性。另外，HITS基因启动子区存在HSF的结合位点，HSF与之结合后能增强HITS基因下游信号的转录，使相关蛋白表达增加[14]。因此，我们猜测，-163T等位基因，由于具备了HSF的结合位点，能上调MEK5蛋白（主要是MEK5α）的表达，造成细胞分裂增殖加快，分化受阻并最终导致结直肠粘膜上皮的癌变。而-163C等位基因，由于不具备HSF和其他转录因子的结合活性，可能下调MEK5的表达（主要是MEK5α），从而对结直肠癌的发病产生保护作用。这与我们的研究结果相一致，如图3所示。

图3 MEK5基因-163T>C转录因子结合活性分析图

尽管我们发现了MEK5 -163T>C多态性与结直肠癌发生降低有关，本研究仍有一些不足之处： （1）我们的研究对象仅限于中国华南地区汉族人群，所以散发性结直肠癌有关的这些基因变异和危险因子是否也同样在其他地区、其他种族人群中有意义仍然需要探讨。（2）本研究是以医院为基础的病例对照研究，所有病例均来自广州地区六家医院，而对照组来自社区，这样的设计难免存在选择偏倚。（3）本研究BMI的调查结果均是在发病后入院时的测量结果，由于肿瘤的消耗作用，大多数结直肠癌患者患病后都会较发病前消瘦，所以应用发病后的BMI数值来研究BMI对结直肠癌的发病风险会对结果存在影响，结果便是造成对肥胖这个危险因素影响效应的低估。这也是目前大多数基因关联分析研究所面临的困难。（4）由于本研究对象病例组收集的新鲜肿瘤标本仅48例，其中为MEK5 -163CC基因型仅1例，因此本研究在人结直肠癌组织中验证不同基因型MEK5蛋白的表达水平所表现的差异是否真的存在仍然需要进一步探讨。（5）本实验应用Taqman-MBG探针法进行基因分型，与测序法比较，结果相符率在96%~98%之间，仍然存在部分误判的可能，从而影响实验结果。但任何一种实验方法都有其固有的局限性，我们实验96%~98%吻合率是可以接受的。

综上所述，作为MEK5-ERK5信号转导通路的关键中间激酶MEK5，其基因启动子区-163突变纯合型CC是中国南方人群散发性结直肠癌发病的独立保护因素，其突变基因型TC/CC在吸烟人群中对散发性结直肠癌的发病也有一定的保护作用，另外，该基因启动子区的多态性与环境因素如吸烟、喝酒和肥胖在结直肠癌的发病上存在一定的交互作用，显示了基因-基因、基因-环境交互作用在结直肠癌发病中的重要作用。而且，初步研究显示MEK5基因-163CC基因型对结直肠癌的保护作用可能是由于其下调了MEK5蛋白的表达。就目前我们所检索到的文献来看，这是目前关于MEK5基因遗传变异和恶性肿瘤易感性的关系的首次报道。我们的发现还需要样本量更大的、最好是以人群为基础的病例对照研究去验证，并有待于基因功能学上的研究去证实。

（本文全英文发表于美国《DNA AND CELL BIOLOGY》，文章结果部分表格及参考文献已略去）