慢阻肺合并肺纤维化金黄地鼠模型的建立及保肺方的干预作用

赵兰才  武维屏

前言

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是世界范围内严重危害民众健康的常见病，是全球第四位的致死原因。肺间质纤维化是COPD常见的合并症，据近年来报道，约90%左右的的COPD患者合并不同程度的纤维化[1][2]，COPD合并肺纤维化被认为是COPD病情发展的必然趋势和结局[1]，其病理机制尚未明了，目前尚无COPD合并肺纤维化动物模型的文献报道，我们用熏香烟烟雾配合气管内注入弹性蛋白酶和博来霉素的方法建立了金黄地鼠COPD合并肺纤维化动物模型，观察模型肺组织重塑的特点及保肺方模型的干预作用，现报道如下： 中国中医科学院西苑医院感染疾病科赵兰才

材料与方法：

1 动物及分组

雄性一级金黄地鼠，鼠龄12周，体重80±20g，共52只，由北京天坛生物制品研究所实验动物室提供。动物室为清洁级，控制温度，给予3天的预备饲养后进行实验。随机分为正常对照组10只、模型Ⅰ组10只、模型Ⅱ组12只、治疗组10只。强地松组10只。

2 主要试剂及药物

弹性蛋白酶              德国宝林蔓公司

盐酸平阳霉素            天津太河制药有限公司

无过滤嘴大前门牌香烟    上海卷烟厂

保肺方水煎液：保肺方由党参、麦冬、五味子、当归等按一定比例组成，药材购于东直门医院，水煎两次，四层纱布过滤，浓缩成1g/1ml的药液。治疗组地鼠按8ml/kg体重/d灌胃（约折合成人用量的8倍）。

3 仪器

小动物呼吸功能测定仪              朝阳医院

光学显微镜                        日本Olympus

熏烟箱                            阜外医院

透射电子显微镜                    日立H-600 

4 模型制作及实验方法

模型Ⅰ组：自第一天始将动物置于熏烟箱(55×53×62cm3)内，每9只香烟相接并固定一端于熏烟箱顶，点燃香烟的下端，任其自燃，燃毕换另9只，每天18只，每周6天，连续3周。第22天用10%水合氯醛腹腔麻醉，直视下气管内注入弹性蛋白酶（20μ/100g体重），注毕轻拍地鼠胸背并旋转，以使药物分布均匀。第29天用同样方法气管内注入盐酸平阳霉素（4.4mg/kg体重），继续饲养2周，第43天取材。

模型Ⅱ组：造模方法与模型Ⅰ组相同，但香烟熏吸时间为4周，气管内注入弹性蛋白酶的用量为28μ/100g体重，气管内注入盐酸平阳霉素的用量为4.8mg/kg体重，其中10只第50天取材。另2只为造模后自然恢复，第64天取材。

治疗组：造模方法同模型Ⅱ组，第50天始每日给保肺方灌胃，治疗2周，第64天取材。

强地松组：造模方法同模型Ⅱ组，第50天始每日给强地松(15mg/kg体重/d)灌胃，治疗2周，第64天取材。

正常组：正常饲养，每日生理盐水8ml/kg体重/d灌胃，第27天和第34天气管内注入生理盐水0.2ml/100g体重，第64天取材。

5 观察指标与测试

5.1 金黄地鼠体重测量

肺功能测定及取材：取材前用动物呼吸功能测定仪测肺功能（呼气阻力（Ri）、吸气阻力(Re)、顺应性（CL）、最大通气量（MVV）、用力肺活量（Fvc）、呼气高峰流速（PEF）、FEV0.3/FVC%），然后开胸取右肺下叶放10%福尔马林中固定，取最大横径约3mm厚标本石蜡固定，行HE染色、Pollek染色；右中肺叶组织切1.5×1.5mm大小组织块，迅速固定于2.5%的戊二醛固定液中，再经1%的锇酸后固定，酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，用透射电镜观察肺泡超微结构。

2.金黄地鼠肺功能测定

地鼠麻醉后气管切开插管,仰卧于密闭体积描记器内,气管插管与描记器外的皮管相连，体积描记器可通过压力换能器测定动物的呼吸压力及体积曲线，计算出呼气阻力（Ri）、吸气阻力(Re)、顺应性（CL）、最大通气量（MVV）、用力肺活量（Fvc）、呼气高峰流速（PEF）、FEV0.3/FVC%。

3．支气管肺组织匀浆羟脯氨酸含量的测定：

根据陈秀銮血清中游离羟脯氨酸测定的改良法测定支气管肺组织中羟脯氨酸含量[3]：⑴ 首先制备标准曲线：取1.5×10cm试管8支，分别加如羟脯氨酸标准应用液（10ug/ml）0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40，各试管用蒸馏水补至0.5ml，摇匀后加异丙醇1ml、氯氨-T溶液0.5ml，摇匀，室温放置4min，加P-DAB溶液1.5ml，摇匀置60℃水浴30min，冷却后移入0.5ml比色杯中，721分光光度计测定波长558um的吸光度，绘制标准曲线。吸光度（X）和羟脯氨酸浓度（Y）间相关系数r=0.999227，直线方程为Y=12.45647-0.18141。⑵ 样品测定：取10%支气管肺组织匀浆液1ml于试管，置沸水中蒸干，在干品中加入蒸馏水0.5ml使溶解，加入异丙醇1ml、氯氨-T溶液0.5ml，摇匀，室温放置4min，加P-DAB溶液1.5ml，摇匀置60℃水浴30min，冷却后移入0.5ml比色杯中，721分光光度计测定波长558um的吸光度，根据直线方程计算10%支气管肺组织匀浆中羟脯氨酸含量。

4. HE染色和Pollak染色: HE染色方法略，pollak染色参照文献方法

5. 统计方法：计量资料组间比较用t检验。

结   果

1 支气管粘膜下成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞计数：见表1

表1 支气管粘膜下成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞计数

淋巴细胞

成纤维细胞

巨噬细胞

正常组

18.61±6.36

9.29±3.21

1.05±0.74

模型Ⅰ组

92.87±18.79※ *

23.71±5.48※ **

6.43±3.21※ ▲

模型Ⅱ组

143.61±28.15※ 

33.43±8.97※

7.19±2.63※

治疗组

116.24±28.18※ ***

23.24±9.11※ **

4.86±2.54※ ***

强地松组

95.76±32.08※ * △

19±6.86※ △ **

3.48±1.59※ * △

※:与正常组比 P<0.001  *:与模型Ⅱ组比P<0.001  **：与模型Ⅱ组比P<0.01   ***:与模型Ⅱ组比P<0.05  ▲: 与模型Ⅱ组比P>0.05 △：与治疗组比P>0.05

1 肺功能：

正常组

模型Ⅱ组

治疗组

强地松组

呼气阻力

8.11±1.27

11.41±3.86

9.79±3.12

9.44±1.43

吸气阻力

7.34±1.58

10.74±3.93

9.41±3.51

8.54±1.71

顺应性

0.068±0.008

0.064±0.014

0.065±0.024

0.058±0.009

最大通气量

111.54±5.29

94.93±5.74※

107.95±5.87★ *

108.86±4.17★ * △

用力肺活量

5.05±0.36

4.83±0.36★

4.92±0.22★**

4.99±0.23★△

呼气高峰流速

18.92±1.07

16.50±1.36※※

17.28±0.65※※**

16.80±1.56※※△

FEV0.3/FVC%

84.80±3.27

72.36±0.51※※※

80.46±1.82※※*

76.61±4.31※△

※：与正常组比P<0.01  ※※:与正常组比P<0.05  ※※※:与正常组比P<0.001 ★：与正常组比P>0.05   *:与模型Ⅱ组比P<0.05 **：与模型Ⅱ组比P>0.05 △：与治疗组比P>0.05

 `

周数

1

2

3

4

5

6

7

8

9

正常组

82.52

83.93

87.43

92.3

95.12

97.74

101.7

102.5

105.6

模型组

89.49

90.96

86.11

89.79

93.71

87.87

87.81

85.85

88.52

预防组

89.94

95.41

93.44

96.55

98.94

92.32

96.1

97.16

98.4

治疗组

88.44

91.43

84.42

88.95

94.27

89.84

96.53

96.38

95.68

强地松组

86.63

95.52

95.19

99.95

98.28

97.84

94.75

90.15

85.31

正常组FEV0.3/FVC%值与其它组比p<0.01,均有极显著差异，表明造摸对动物肺通气功能严重损伤；模型组FEV0.3/FVC%值与其它组比p<0.01,有极显著差异，表明各组药物对造摸的损伤有干预作用，可减轻造模因素对动物通气功能的损害，强地松组与预防组和治疗组比差别不显著（p>0.05）,表明三者改善气道阻塞的作用程度相差不显著，但预防组和治疗组FEV0.3/FVC%值有较强地松组增高的趋势。

2 病理形态

HE染色：模型组在气管给予平阳霉素后2周时可见明显肺气肿征象和肺间质成纤维细胞增生、聚集，肺泡间隔增厚肺泡腔增大，细气管周围炎症细胞浸润。

随着造模时间的延长，在气管给予平阳霉素后4周时肺泡损伤和肺间质成纤维细胞增生更明显，且小血管壁增厚，肺泡壁断裂，肺大泡形成，成纤维细胞灶形成。

保肺方预防组在气管给予平阳霉素后2周时肺组织HE染色，见肺泡结构较完整

预防组在气管给予平阳霉素后4时肺组织HE染色，见肺泡结构有一定程度破坏肺泡壁增厚，细支气管周围炎性细胞浸润：

强地松组在气管给予平阳霉素后2周时肺组织HE染色，见肺泡结构亦完整，但炎性细胞浸润较多：

4周时病变加重：

三型前胶原讨论：

肺气肿合并肺纤维化动物模型的建立是一项探索性工作，通过实验得出以下体会：（1）多种因素造模对动物损伤较大，要充分考虑动物的承受力，以减少死亡率；（2）要合理按排好各造模因素的施加时间，对动物损伤小的因素要先施加，损伤重的因素要后施加，在末次施加造模因素后，一旦动物衰竭将死，可及时取材，以了解不同时间段模型形成情况和动物致死原因。（3）疾病复合模型的建立要密切联系临床，以决定各疾的主次轻重，观察评价指标要围绕疾病特征进行设计。

以上问题有待今后实验中逐步解决，若能充分考虑实验过程中可能遇到的问题，并进行预实验，上述肺气虚证慢阻肺合并肺纤维化动物模型的建立是可以成功的，以此为起点，可逐渐探索出一条病证结合模型复制的新途径。

 参考文献

[1]单兆运,陈治安,马文富,等.慢性阻塞性肺疾病合并肺间质纤维化的光镜/电镜及免疫病理研究.中华结合和呼吸杂志,1990,13(5):311~313.

[2]杜敏捷,王辰,曹大德,等.慢性阻塞性肺疾病合并肺间质纤维化的病理学研究.中华结核和呼吸杂志,1999,22(1):30~32.