一、核苷(酸)类似物耐药的病毒学基础

　　HBV侵入人体后，与靶细胞膜上的受体结合，脱去包膜，进入细胞质中，脱去核衣壳，部分双链环状HBVDNA进入靶细胞核中，在DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长正链，修补裂隙区，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。HBVDNA的复制首先以cccDNA为模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，转录成3、5kb、2、4kb、2、1kb和0、7kb等。

　　HBV每24h可复制1012～1013拷贝。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA-DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA-RNA-DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，介于其他DNA病毒和RNA病毒之间，大约为1/105。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别，因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的动态变化的病毒群，即HBV以准种的形式存在。

　　HBV病毒群的演变也符合达尔文进化论的规律。有些位点的变异，可能是致死性的，发生这种变异的HBV不能存活。有些位点的变异对其复制能力没有显著影响，但很多位点变异导致子代病毒复制能力降低或增强。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择压力的影响。

　　核苷(酸)类似物的作用机制：其进入机体后，形成三磷酸活性成分，与机体天然的脱氧三磷酸核苷竞争性结合到HBV聚合酶上。但由于三磷酸化的核苷(酸)类似物不具备天然的dNTP的结构，而使HBV的DNA链合成终止，这是核苷(酸)类似物抑制HBV复制的机制。但如果患者体内的HBV序列发生变异，导致产生的HBV聚合酶与核苷(酸)类似物结合力降低，那么变异的HBV即不受核苷(酸)类似物的抑制或抑制能力下降。因此，在继续应用核苷类似物治疗的情况下，野生株病毒因对核苷(酸)类似物敏感而继续被抑制;变异株病毒因具备一定的复制能力，而且对核苷(酸)类似物不敏感而逐渐替代野生株，成为体内HBV的优势株，从而导致患者对于核苷(酸)类似物的耐药。

　　二、核苷(酸)类似物耐药变异相关概念及命名方法

　　(一)耐药变异相关概念

　　常用的HBV耐药变异相关术语或概念有：

　　1、原发性无应答：指核苷(酸)类似物治疗12周，HBVDNA载量的下降幅度小于1log10IU/ml。原发性治疗失败可能与宿主、药物或病毒等因素相关：患者依从性差、药物吸收障碍、药物在体内转换成活性成份能力差;药物的抗病毒效力弱或治疗剂量太小;HBV发生耐药变异等均可造成原发性治疗失败。

　　2、病毒学突破：指在治疗过程中，相隔1个月的连续两次检查，血清HBVDNA载量比获得应答后的最低值的上升值均大于1log10，病毒学突破在治疗依从性良好的患者常常提示耐药的产生。

　　3、病毒反弹：指患者治疗后获得病毒学应答，虽继续治疗，HBVDNA载量升高≥20000IU/ml或高于治疗前水平。

　　4、生化学突破：指治疗达到血清ALT复常后，在继续治疗的过程中，ALT水平升高并超过正常值上限。当ALT水平上升大于5倍正常值上限则称为肝炎突发。

　　5、原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感性下降。如rtM204V/I的变异病毒株对LAM的敏感性显著下降。虽然原发性耐药变异株对药物的抵抗性增加，但也常导致变异病毒本身的复制能力下降。

　　6、继发性耐药变异：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感性的进一步下降。如在LAM的耐药变异中，rtM204V/I为原发性耐药变异，常常伴随的rtL180M变异为补偿性耐药变异。

　　7、基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异。

　　8、表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感性。当抑制病毒复制所需的EC50与野生株相比增加100倍以上称为高度耐药、10～99倍为中度耐药、2～9倍为轻度耐药。

　　9、交叉耐药：对一种核苷(酸)类似物耐药的HBV变异对其他一种或多种核苷(酸)类似物也具有耐药性。如LAM治疗发生在rtM204I的耐药变异株，对LdT也具有耐药性。

　　10、多药物耐药：指当不同作用靶位的药物进行序贯或同时治疗，HBV可在不同药物的靶位发生耐药变异，产生对多种药物耐药的变异病毒株。如LAM治疗后，病毒变异发生在rtM204V/I和rtA181T/V，则该病毒株对LAM和ADV均耐药。

　　基因变异是导致病毒耐药的基础。在临床中首先出现基因变异，然后出现病毒学突破和病毒反弹，再出现生化学突破。对临床病毒耐药检测结果的解释，需要结合病毒载量的变化、检测试剂和方法及临床表现来综合分析。

　　(二)耐药的命名方法和书写格式

　　HBV聚合酶可分为4个不同的功能区：末端蛋白、间隔区、逆转录酶区。已知的耐药变异均位于逆转录酶区内。8种基因型HBV的逆转录酶均由334个氨基酸残基组成，因此目前国际通用的HBV耐药变异从rt第1位氨基酸残基作为起始，书写格式为“rt-野生型氨基酸缩写-相对于逆转录酶区起点的氨基酸变异位点-变异后的氨基酸缩写”，如rtM204V表示逆转录酶区的第204位由蛋氨酸(M)变异为缬氨酸(V)。当在同一位点出现2种以上的氨基酸改变即混合HBV病毒群时，应同时将两种氨基酸改变列出。

　　三、核苷(酸)类似物常见耐药变异位点与变异发生率

　　1、与拉米夫定耐药相关的变异：现有研究表明，LAM常见耐药相关变异为rtM204I/V±rtL180M变异，其中rtM204V多与rtL180M变异联合出现，rtM204I变异可单独出现。根据已公布的LAM治疗核苷(酸)类似物初治患者的关键性临床试验(pivotaltrials)数据计算的1～5年累积耐药发生率分别为24％、38％、49％、67％与70％。

　　2、与阿德福韦酯耐药相关的变异：现有研究表明，ADV常见耐药相关变异为rtN236T与rtA181V/T变异，两个位点变异可单独或联合出现。根据已公布ADV治疗核苷(酸)类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的HBeAg阴性患者1～5年累积耐药发生率分别为0％、3％、11％、18％与29％。

　　3、与恩替卡韦耐药相关的变异：目前研究结果显示，ETV耐药相关变异是在rtM204V+rtL180M变异基础上，再联合rtT184、rtS202或rtM250三个位点中至少一个位点的氨基酸替代变异。根据已公布ETV治疗核苷(酸)类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的1～5年累积耐药。

　　4、与替比夫定耐药相关的变异：目前研究结果显示，LdT常见耐药相关变异为rtM204I。其他位点如rtA181V/T等尚存在争议。根据已公布LdT治疗核苷(酸)类似物初治患者的关键性临床试验数据计算的第1与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。

　　需要说明的是，以上各种药物所涉及的慢性乙型肝炎的人群和设计均有所不同。

　　四、乙型肝炎病毒耐药变异的检测与分析

　　(一)常用基因型耐药检测技术

　　1、PCR产物直接测序：是将HBV基因组的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序分析的方法。PCR产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点，是最常用的基因型耐药检测方法之一。Keefffe等认为PCR产物直接测序的方法应作为基因型耐药检测的金标准。该方法的缺点是灵敏性较差，只有当变异株超过HBV准种池的20％时才能被发现。

　　2、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性：该方法具有较强的灵敏性，可检测数量占HBV准种池5％的耐药变异株，曾被国内外众多实验室应用于LAM耐药变异检测工作中，近来国内也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。然而PCR-RFLP只能检测已知、单位点的变异，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。但随着多种核苷(酸)类似物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难以胜任多位点变异的检测。

　　3、反向杂交法：基于该技术的INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测，目前可检测包括LAM、ADV、ETV与LdT常见位点耐药位点。该法可检测变异株占HBV准种池5％～10％的样品，故敏感性较好，但其同样只能检测已知位点变异，另外该检测价格昂贵，国内尚难广泛应用于临床检测。

　　4、实时PCR：该方法操作简便，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。缺点为仅能检测已知位点;同时，针对每个位点的不同变异均需合成相应的探针，随着核苷(酸)类似物耐药位点的增多，相应合成探针的费用增高。国内已有经SFDA批准的实时PCR试剂盒用于rtM204V/I变异的临床检测。

　　5、基因芯片：亦称DNA芯片、DNA微阵，具有快速、高效、敏感、平行化和自动化等优点，可检测已知变异位点。另外随着基因芯片高通量测序技术进展，还可用于检测未知变异位点。目前国内用于核苷(酸)类似物耐药临床检测的芯片正在研发中。

　　6、限制性片段质谱多态性技术：该技术是将PCR-RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合，灵敏度高，能够发现数量不足HBV准种池1％的变异株，但其同样仅能检测已知位点变异，且价格昂贵，很难在临床推广应用。

　　(二)体外表型分析

　　体外表型分析是确认基因型耐药的“金标准”，常用半数有效浓度来评价耐药程度的高低。其原理是将含有待检测耐药变异位点的HBV全基因组导入肝细胞来源的细胞系，再将不同浓度梯度的核苷(酸)类似物加入细胞培养液中，经过一定培养时间后检测药物作用下HBVDNA的复制情况，计算EC50，通过与野生株病毒的EC50比较，判断该变异对核苷(酸)类似物的敏感性。

　　(三)虚拟表型分析

　　进行虚拟表型分析的前提是建立包含相互关联的临床资料、基因型和表型耐药信息的HBV耐药变异数据库。当向数据库提交一待分析序列时，数据库会查找与该序列最匹配的HBV序列，根据其匹配序列的临床以及耐药检测情况来推断待分析序列耐药变异情况。作为研究表型耐药的一个辅助手段，虚拟表型分析虽不能取代体外表型试验，但将有助于已知耐药变异的监测和新变异的发现。目前，可利用的数据库包括澳大利亚的。

　　五、乙型肝炎病毒耐药变异的临床处理

　　(一)乙型肝炎病毒耐药变异的预测因素

　　多种因素可能与HBV对核苷(酸)类似物耐药发生几率相关，包括应用核苷(酸)类似物种类、初始治疗时HBVDNA载量、有肝纤维化/肝硬化基础、曾接受过核苷(酸)类似物抗病毒治疗等。此外，男性患者、体重指数高及酗酒等也是抗病毒治疗中易发生耐药变异的高危因素。但是越来越多的研究提示早期病毒学应答情况是预测耐药发生率的重要指标。

　　(二)乙型肝炎病毒耐药变异的预防策略

　　1、合理选择核苷(酸)类似物抗病毒治疗的适应证：对免疫耐受期或非活动期HBV感染者，尤其是年龄较轻者，如不需要接受免疫抑制剂或化疗药物治疗，则不建议应用核苷(酸)类似物。对于初次出现活动的慢性HBV感染者，特别是年龄较轻者，应充分分析其诱发因素而慎重决定应用核苷(酸)类似物。

　　2、合理选择抗病毒治疗方案：治疗方案建议参考中国《慢性乙型肝炎防治指南》。对有抗病毒治疗适应证的患者，若选用核苷(酸)类似物，尽量选用抗病毒作用强、耐药变异发生率低的药物;同时，一定要了解既往抗病毒治疗情况，包括核苷(酸)类似物应用情况、治疗应答情况及耐药变异情况，以便选择无交叉耐药的药物治疗。此外,应尽量避免单药序贯治疗，以免多药物耐药的发生。

　　3、提高患者的依从性：在用核苷(酸)类似物进行抗病毒治疗期间，要反复强调遵医嘱按时、足量服药。对临床试验数据分析表明，超过30％的病毒学突破是由患者依从性差造成。在任何情况下，逐步减量的用药方案都是错误的，将显著提高耐药风险。

　　4、规范监测HBVDNA与基因型耐药，及时调整治疗方案：HBVDNA载量是应用核苷(酸)类似物抗病毒治疗过程中耐药监测的最重要指标。治疗期间应定期检测HBVDNA水平。大量临床试验数据表明，早期病毒学应答情况是预测耐药发生率的重要指标，因此APASL与EASL指南均建议根据早期病毒学应答情况来调整治疗方案，以提高疗效，降低耐药发生率。

　　现有指南均未推荐将基因型耐药检测作为核苷(酸)类似物抗病毒治疗常规检测对于核苷(酸)类似物治疗过程中出现病毒学突破的患者应进行基因型耐药检测;除非有明确证据表明初治患者感染HBV来自于接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗患者。一般不主张对患者在初治治疗时进行基因型耐药检测。

　　(三)已发生耐药变异的临床处理建议

　　对少数治疗前ALT正常、肝组织学检查炎症或纤维化病变轻微。