精液蛋白17（Sp17）靶向的卵巢癌肿瘤疫苗

宋坤 孔北华山东大学齐鲁医院妇科宋坤

癌-睾丸抗原（CT抗原）是一组睾丸组织特异的蛋白质，可在多种肿瘤细胞中异常表达，而在睾丸外正常组织中表达受限。最近发现Sp17为CT抗原家族成员，是具高度免疫原性的人类自身抗原，其结构中含细胞毒性T淋巴细胞（CTL）抗原决定簇，因此可作为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。为探讨Sp17作为卵巢癌免疫治疗靶分子的可行性，选用三例卵巢癌患者肿瘤标本进行研究。逆转录多聚酶链反应（RT―PCR）、溴乙非啶琼脂糖凝胶电泳显带检测Sp17在肿瘤标本中的表达。密度梯度离心从外周血中分离单个核细胞（PBMCs），种植于含RPMI 1640加10%胎牛血清的培养皿中，培养基中加入粒-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4（IL-4）,培养7天后收获细胞即为树突状细胞（DCs）。用阳离子脂质体DOTAP将从埃氏大肠杆菌中获得的Sp17联合蛋白传递给DCs，使之成为Sp17抗原递呈细胞。新鲜外周血单个核细胞与携带Sp17的DCs以10：1比例混合培养，加入IL-2、自身血清和IL-7 于37℃孵育，每3～4天加入IL-2，每周加入自身PBMCs饲养细胞和Sp17联合蛋白，4个周期后收获T淋巴细胞用于细胞毒实验。以EB病毒转染的表达或不表达Sp17的自身淋巴母细胞株（LCL）和自身卵巢癌细胞为靶细胞，用标准4小时铬释放实验检测经Sp17抗原刺激的T淋巴细胞的细胞毒性。培养基中加入抗人类白细胞抗原-Ⅰ（HLA-Ⅰ）和抗HLA-Ⅱ抗体，以研究细胞毒作用对HLA的依赖性。流式细胞仪技术分析T淋巴细胞的表型和其细胞内淋巴因子的含量。

结果显示，10个新鲜卵巢癌标本中7个Sp17阳性，Sp17表达率为70%。肿瘤组织和正常睾丸组织一样表达丰富的Sp17分子。通过DCs将Sp17递呈给PBMCs以及Sp17联合蛋白的致敏作用，培育出Sp17特异的T淋巴细胞，其作为效应细胞在细胞毒实验中可有效的杀伤表达Sp17的自身LCL。LCL细胞的溶解具Sp17依赖性，未转染Sp17基因即不表达Sp17的LCL并不溶解（P0.00001）。另外，研究还发现靶细胞的溶解受HLA-Ⅰ限制，细胞毒作用可为抗HLA-Ⅰ单克隆抗体阻断，抗HLA-Ⅱ单克隆抗体对细胞毒活性似乎并无影响（P0.000001），提示参与细胞毒作用的T淋巴细胞为CD8阳性，即细胞毒T淋巴细胞（CTL），同时提示患者免疫系统中存在Sp17特异的CTL。以自身肿瘤细胞为靶细胞的细胞毒实验中，3例患者的肿瘤细胞都被杀伤，此作用也可为抗HLA-Ⅰ抗体阻断而抗HLA-Ⅱ抗体对其无影响，再一次提示Sp17阳性肿瘤患者体内存在与HLA-Ⅰ相关的Sp17特异的CTL，也证明Sp17联合蛋白可致敏识别Sp17的CTL并使其增殖，其所需浓度与表型同Sp17阳性肿瘤细胞表面的Sp17相似。用刀豆素A（CMA）和布雷非德菌素A分别处理CTL，结果发现CMA可完全消除Sp17特异的CTL对自身瘤细胞的溶解作用，而布雷非德菌素A对此无明显影响。CMA可选择性的抑制Perforin途径的靶细胞溶解而布雷非德菌素A可抑制Fas介导的凋亡途径，由此证明Sp17特异的CTL是通过Perforin途径介导靶细胞溶解的。流式细胞仪结果显示实验所培育的T淋巴细胞表型多为CD8阳性，与细胞毒实验结果符合，证明效应T淋巴细胞为CD8阳性，即CTL。Sp17联合蛋白再次刺激T淋巴细胞后，双色流式细胞仪技术发现CTL主要产生IFN-γ和可检测量的IL-4，与辅助T淋巴细胞1（Th1）的细胞因子图象一致。

通过本研究，可以认为Sp17用做卵巢癌肿瘤疫苗的靶分子是可行的。