研究华蟾素(Cinobutacini，CIN)对喉癌细胞的诱导分化作用。方法体外培养喉癌细胞(Hep一2)放射性同位素掺入法检测CIN对Hep一2的生长抑制作用，原位杂交方法检测c―myc(细胞核内癌基因)的表达变化。结果CIN低浓度在24小时内有促进Hep一2细胞分裂、增殖并诱导细胞分化作用；高浓度作用72小时则抑制Hep一2细胞生长。3H一脱氧胸苷(3H―TdR)掺人量检测提示，CIN短时间作用的Hep一2细胞cpm(每分钟脉冲数)值增高，而长时间作用组则cpm值下降。CIN作用48小时后，Hep一2细胞内c―myc蛋白表达较对照组低，但较平阳霉素组高。结论中药华蟾素在低浓度和时间相对较短时对人喉癌Hep一2细胞具有诱导分化作用，当作用时间超过72小时，则表现为抑制肿瘤细胞生长作用。
　　从天然动植物中纯化有效的抗癌成分并制备注射液，一直是许多研究人员努力的方向，并已有用于病毒性肝炎、肝癌、胃癌治疗的临床报道，但在头颈部肿瘤领域则少有文献涉及。本研究主要采用体外细胞培养及放射性同位素掺入法、分子原位杂交技术探索CIN对人喉癌细胞株Hep一2的诱导分化作用，为深入研究提供实验依据。
　　材料与方法
　　1、细胞株
　　人喉癌Hep一2细胞株购自北京耳鼻咽喉科研究所。培养液为RPMI一1640(GBCO)美国，pH值6．8～7．0，含10％小牛血清，青霉素、链霉素各100tLg／ml，细胞置CO：孵箱培养。
　　2、药品
　　华蟾素，安徽淮北生化制药厂生产，批号：884；c―myc单抗购自北京中山生物技术有限公司；3H一脱氧胸苷(3H―TdR)由海军总医院中心实验室赠；原位杂交检测试剂盒购自北京大学医学院病理教研室；平阳霉素，天津市河北制药厂生产。
　　3、实验方法
　　实验分三组，未加药组，CIN组，平阳霉素组。在96孔板上将CIN和平阳霉素以不同终浓度(O．1tlg／ml，1．0tlg／ml，10btg／m1)、不同时间(24h，48h，72h)作用于Hep一2细胞。光镜下观察细胞形态。每一药物浓度取12孔；每一时间单位取48孔(包括
　　未加药组)，总计144孔。每项实验重复3次。
　　3．1光镜、电镜观察
　　用光镜、电镜观察在不同浓度、不同时间CIN作用条件下对Hep一2细胞形态的影响。3．2 3H―TdR掺入取4h、48h两个时段1．0ttg／mlCIN作用的Hep一2细胞(每孔8000个细胞)，每孔加入0．1ml 3H―TdR(相当于0．1t比ci)，CO。孵箱37℃继续培养24h，去培
　　养液，生理盐水洗两次，胰酶消化并吹打后用自动细胞收集器收集在玻璃纤维滤纸上，三氯醋酸固定，无水乙醇处理后60。C烘干，在液体闪烁计数器测量每份样本的CPM。实验组及对照组均取三个复本的CPM值进行统计学处理。
　　3．3原位杂交试验
　　参照文献叫方法，按照原位杂交检测试剂盒要求顺序操作。于6孔板内盖玻片上培养的Hep一2细胞经CIN(0．1ttg／ml，1．0tlg／ml，10ttg／m1)--"个不同浓度作用24h和72h后，在盖玻片上直接进行C―myc原位杂交试验。爬满细胞的盖玻片经4％多聚甲醛固
　　定10分钟，PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗，3％H。o。封闭，0．1N HCI处理，PBS冲洗后再4％多聚甲醛固定10分钟，90％乙醇脱水15秒，每片滴加20td杂交液，其中HybA液18tA，Hyb B液2td(即生物素标记探针)，混匀，80℃加热10分钟，湿盒中42℃22小时
　　保温。50％甲酰胺2 XSSC(氧化钠柠檬酸钠缓冲液)37℃洗30分钟马血清(1：100)封闭60分钟，avidin―biotin―HRP(1：100)室温37℃1小时保温孵育，1×PBS冲洗，显色液DAB―H。O。显色30分钟。
　　3．4图像分析
　　应用北京航空航天大学图像中心多功能真彩色图像处理分析软件(CMIAS一008)对原位杂交图像进行分析。选取细胞分布均匀的5个高倍(X400)视野作为观察区进行检测分析。
　　结果
　　1、细胞形态学变化光镜下观察三种浓度CIN作用的Hep一2细胞在24h内，细胞较未加药对照组的细胞增生活跃，分裂像增多，细胞轮廓清楚，结构紧密，以0．1ug／ml浓度组最明显。随CIN作用时间延长时则出现细胞生长抑制现象，细胞变肿胀，体积大小不一，有的细胞变成棱形，核浆比例减小，甚至出现细胞崩解，核碎裂，核固缩现象，以10td／ml浓度组表现最突出。透射电镜下观察见，未加药对照组Hep一2细胞表面有许多微绒毛，细胞器存在，胞质密度高，核仁大且不规则。在0．1t,g／ml浓度的CIN作用24h内的Hep一2细胞可见细胞绒毛减少，细胞表面平滑，核质比例减小，核仁及细胞器趋向规则化，当CIN作用时间延长到72h或浓度增高到10tLg／ml时观察的Hep一2细胞胞浆内有空泡出现，有的核质出现固缩或碎裂，有膜包裹的凋亡小体出现。平阳霉素组Hep一2细胞的形态同10t卫l／ml浓度、72h的CIN作用组相同，但没有表现出促进细胞增殖的作用。
　　2、3H―TdR掺入试验
　　经液体闪烁计数器测定记录每份样本的每分钟脉冲数，根据每组三个复孑L的平均CPM值进行统计学处理，计算结果见表1。实验结果表明Hep一2细胞经CIN(1．0t,g／m1)72h作用后3H―TdR的掺入量较未加药组降低(P<0．05)，但没有平阳霉素组降低的明显。< p="">
　　3、复位杂交结果
　　Hep一2细胞经CIN作用48h(浓度为1．0／．tg／m1)后的原位杂交试验显示：在细胞浆和细胞核中均可见到紫褐色杂交颗粒，应用多功能真彩色图像处理观察系统处理结果见表2，统计学结果显示CIN组的c―myc蛋白表达较未加药组低(P<0．05)。< p="">
　　表2 CIN作用48h(1．Optg／m1)后原位杂交图像分析结果
　　讨论
　　肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，人类生存环境中即有致癌物质、促癌物质，也有能促进癌的细胞向正常细胞转化的物质。本研究表明，CIN在短时间、低浓度、长时间、高浓度等实验条件使Hep一2细胞产生不同形态学变化，其作用结果与药物作用的
　　时间和浓度密切相关。通过正常细胞分化包括形态分化和功能分化，细胞形态学改变是细胞分化的表型基本特征之一[2]，通过光镜、电镜观察发现：CIN短时间作用(24h、48h)和低浓度作用的Hep一2细胞以细胞增殖，向高分化发展为主；而经长时间72h作用的细胞则出现细胞生长分裂抑制现象，由此说明CIN对Hep一2细胞所具有的促进细胞向高分化诱导分化作用和抑制其生长、分裂的双重作用是同CIN作用时间和浓度密切相关。为进一步确定CIN在不同时间对Hep一2细胞增殖的影响，实验中用同一种药物浓度的CIN进行3H―TdR掺入试验，与未加药组进行对比得出结果；经CIN作用72h的Hep一2细胞由增殖旺盛变为增殖抑制。但CIN作用的程度尚没有平阳霉素作用明显。
　　目前研究已证明c―myc癌基因是表达蛋白质位于细胞核内起作用的癌基因，其编码基因的5’端上游序列及第一个外显子样结构参与转录和翻译的调控。第一个外显子或内含子的缺失或突变可导致c―myc蛋白表达的异常[3]，c―myc癌基因是参与细胞转化、分化和细胞周期调节的重要基因，它的表达失调或过度表达在肿瘤生长的各阶段均起关键性作用n]。本研究发现CIN作用Hep一2细胞的原位杂交图像处理值，与未加药的对照组相比，处理组Hep一2细胞中c―myc基因表达产物降低。由此表明CIN在诱导肿瘤细胞的分化及凋亡中均起重要作用，并且其作用的原理并非细胞毒作用，可能是通过抑制癌基因表达而抑制细胞增殖、诱导细胞分化。虽然CIN对喉癌细胞的诱导分化及生长抑制是体外研究结果，但可预示CIN对喉癌的防治具有良好前景，预期临床应用即可促进肿瘤细胞逐渐向高分化转化，而减少由于细胞坏死带给肌体的副作用，又增强肿瘤细胞凋亡，使肿瘤自然消退来治疗肿瘤。同时CIN可降低细胞毒药物的用量，克服肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性。因此CIN可考虑作为一种辅助药物起到防治肿瘤作用。