[摘要] 目的：探讨甘露糖结合蛋白（MBP）基因突变与慢性及重型乙型肝炎的相关性。方法：采用基因扩增和DNA测序方法检测了64例健康人和52例慢性乙肝及62例重型乙肝患者MBP基因第一外显子的DNA序列，然后与GeneBank中参照序列进行比较分析。结果：三组人群中MBP基因仅存在密码子54突变，而无密码子52、57的突变。健康人、慢性乙肝和重型乙肝组密码子54突变率分别为14.1%(9/64)、15.4%(8/52)和35.5%(22/62)，前两组间比较无统计学差异(P＞0.05)，而重型乙肝组密码子54突变率则分别显著高于前两组(χ2=7.79，P＜0.01;χ2=5.89,P＜0.05)。结论：该地区乙肝人群MBP基因仅存在密码子54突变, 突变与乙肝慢性化无明显关系，而与重型肝炎的发生有显著相关性。故监测MBP基因突变可作为重型肝炎判断预后的一个可行性指标。苏州市第五人民医院肝病科童福易

[关键词] 甘露糖结合蛋白；基因突变；乙型肝炎；慢性；重型

Relationship between the gene mutations of mannose binding protein and the progression of hepatitis B infection。

TONG Fu-yi*, GAN Jian-he. *Institute of Hepatology, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou 215007

Corresponding author: TONG Fu-yi, E-mail: tongfy@163.com

[Abstract]  Objective To understand the relationship between the gene mutations of mannose binding protein(MBP) and the progression of hepatitis B. Methods The MBP gene mutations in 52 patients with chronic hepatitis B and 62 patients with severe hepatitis B and 64 HBsAg-negative healthy controls were investigated. The mutations in MBP gene were analysed by polymerase chain reaction (PCR) assay and direct DNA sequencing. Results At MBP gene mutations in codons 52, 54 and 57,only a mutation in codon 54 was found. The mutation frequency in group of severe hepatitis B (35.5%, 22/62) was higher than in group of chronic hepatitis B (15.4%, 8/52) and HBsAg-negative healthy controls（14.1%，9/64）,respectively, and their difference was significant (χ2=7.79，P＜0.01;χ2=5.89,P＜0.05). The difference of in group of chronic hepatitis B and in group of HBsAg-negative healthy controls was no significant (p＞0.05). Conclusions There is only mutation in codon 54 of the MBP gene in patients with hepatitis B infection in the area.Codon 54 mutation of MBP is not related to the persistence of hepatitis B,but it was associated with progression of hepatitis B infection.

[Keywords] mannose binding protein; gene mutation; hepatitis B; chronic; severe

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    基金项目：苏州市第十六批科技计划项目（SZD0343）

作者单位：215007苏州市第五人民医院肝病研究所（童福易）；苏州大学附属第一医院（甘建和）

通讯作者：童福易，E-mail: tongfy@163.com  电话：0512-68672297

甘露糖结合蛋白(mannose binding protein,MBP) 或甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL),是一种钙依赖性糖结合蛋白,属于凝集素家族,广泛存在于人的肝脏和血液中，MBP是第一个被发现具有防御功能的C型凝集素，结构类似补体成分C1q，是天然免疫（innate immunity）的机体防御分子(host defense molecule), 在宿主免疫防御中发挥重要作用。HBV的HBsAg上具有丰富的甘露糖末端的碳氢链,可能是供MBP结合的靶位,故可通过血清MBP与HBV的结合而进行调理作用。MBP-HBV复合物可被补体中和,还可能通过补体受体或直接通过细胞表面MBP受体从血液中清除。并且因此增强从外周血中清除HBV的能力[1]。但是，MBP基因在乙型肝炎中易产生变异，干扰MBP的二级结构，产生无功能的蛋白质，是血清MBP水平低下和调理缺陷的根本原因。因此，研究的乙肝患者MBP基因变异具有重要的意义。

MBP基因定位于10号染色体长臂（10q11.2～q21），其cDNA全长约30kb，有4个外显子。目前所发现的MBP基因结构区变异均为第一外显子的点突变，分别为密码子52（CGT→TGT）、54（GGC→GAC）和57（GGA→GAA）。重型乙肝是机体在HBV等多种致病因子作用下，肝细胞在短期内的广泛变性、坏死所致的肝功能衰竭的一类综合征，病情重、发展快、并发症多、病死率高，具体发病机制不很清楚，但遗传因素可能是影响重型乙肝的发生发展及预后的重要因素之一[2]。MBP基因突变与重型乙肝的关系国内尚未见报道，因此有必要对乙肝患者中的MBP基因变异进行相关性研究和探讨。

1 资料与方法

1.1研究对象

    114例乙型肝炎患者，来源于2003年6月～2004年12月苏州市第五人民医院和苏州大学附属第一医院的住院患者。诊断符合2000年西安会议修订的病毒性肝炎诊断标准[3]。其中慢性肝炎52例，重型肝炎62例；男性62例，女性52例；年龄18～65岁。并以64例健康体检人作为对照。以上各组资料均具有可比性。所有病例排除其它病毒感染和肿瘤及自身免疫病，未使用过免疫制剂。收集EDTA抗凝血2ml供提取基因组DNA备用。

1.2 试剂及仪器

1.2.1试剂  MBP基因第一外显子扩增引物为p1：5'-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3’；p2:5-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3’,由上海生工公司合成，扩增片段包含密码子52、54和57； PUREGENETM全血基因组DNA（gDNA）抽提试剂：美国GENTRA公司产品；全血gDNA纯化试剂：宁波中鼎生物技术公司；Ready-to-use PCR Kit:加拿大BBI公司产品；CEQTMDTCS-Quick Start Mix、Glycogen、CEQTMSample Loading Solution(SLS)、CEQTMSEPARATION BUFFER和MINERAL OIL: 美国Beckman-Coulter公司产品；MinEuteTMPCR Purification Kit:德国QIAGEN公司产品；100mMEDTA和3MNaOAC:本研究所配制;无水乙醇：常州武卫试剂厂。

1.2.2  仪器  ZWF-1型紫外透射发射分析仪：上海金达生化仪器厂；FS 600电泳仪：上海复生生物工程研究所；TGL-16G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；Sigma 3k-15 高速冷冻离心机,德国Sigma公司产品;GeneAmp9600基因扩增仪, 美国Applied Biosystems 公司生产。CEQTM8000基因测序仪，美国Beckman-Coulter公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA的提取  全血gDNA的提取按试剂盒说明书操作。

1.3.2 MBP基因的扩增  ①吸取gDNA模板3ul，加入PCR Kit中的Mix（含p1、p2、Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+等）中，反应体系30ul，置GeneAmp9600基因扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5min后，94℃变性30sec,56℃退火40sec,72℃延伸5min，循环35次，最后4℃保存。②取扩增产物5ul加入含有溴乙锭（0.5ug/ml）的2%琼脂糖凝胶，并设置DNA Marker，90V电泳15min。用紫外透射发射分析仪鉴定产物质量。③将扩增产物加入QIAquick纯化柱，按试剂盒说明书进行纯化。纯化产物即可用于测序反应。

1.3.3 DNA序列分析  ①取纯化产物、DTCS Mix、测序引物p1或p2及ddH2O若干配成20ul反应体系，置GeneAmp9600基因扩增仪进行测序反应（标记）。反应条件为96℃20sec, 50℃20sec, 60℃4 min, 循环30次后4℃保存。②标记产物加EDTA和NaOAC及Glycogen以终止，加60ul95%冰乙醇，14000rpm4℃离心20min,70%乙醇洗涤两次，空干。③加25ulSLS溶解，转移至96孔上样板，加MINERAL OIL后置CEQTM8000基因测序仪进行DNA测序。测序仪可自动变性、自动取样，采用毛细管电泳、激光探测荧光，计算机用Run、Sequencing、Investigator软件进行处理，并与GenBank中标准序列(ACCESSION：AF080508  GI：3420793)进行比较分析。

1.4 统计方法

率的比较采用X2检验，并计算比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI）。

2 结果

MBP基因第一外显子密码子52、54和57中，密码子52、57均未发现突变，仅存在密码子54突变：GGC→GAC, 即G54D，为错义突变。MBP基因DNA序列代表图谱见附图。健康对照、慢性乙肝和重型乙肝三组密码子54突变率见表1。

表1 三组MBP基因密码子54突变率

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 分    组       例数    突变型GAC(%)  野生型GGC(%) 

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Ⅰ 健康对照组     64       9（14.1）       55（85.9）

Ⅱ 慢性乙肝组     52       8（15.4）       44（84.6）

Ⅲ 重型乙肝组     62       22(35.5)         40(64.5)

合计      178      39              139

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注: 三组总体比较,χ2=10.27,P＜0.01. 而Ⅲ与Ⅰ比较,χ2=7.79, P＜0.01, OR=3.36, 95%CI (1.44-7.85);

Ⅲ与Ⅱ比较,χ2=5.89,P＜0.05, OR=3.03, 95%CI (1.23-7.44); Ⅱ与Ⅰ比较,χ2=0.04, P＞0.05

3 讨论

我国乙型肝炎病毒（HBV）自然感染率高达42.4%～80.7%，而转归差异大，可以为不受感染、暴发性肝炎、自限性肝炎或慢性感染以致进展成为肝硬化及肝癌，这种HBV感染自然史多样性的原因除与病毒的毒力外,与宿主对HBV感染的敏感性,即与宿主的遗传多态性也有一定的关联。

MBP为天然免疫防御分子，在宿主免疫防御中发挥重要作用:(1)可以屏蔽致病原入侵,同时也是激活补体MBL途经的关键成分,使得它从而构成人体首道防线。(2)能识别并结合以甘露糖残基和(或)N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylylucosamine,NG LcAc)为末端糖基的糖蛋白，该结构在微生物或异种抗原表面分布广泛。它能识别病毒、细菌和真菌等。MBP与致病原表面结构结合后，可以通过与吞噬细胞胶凝集素受体（Collectin receptors）结合而发挥直接调理作用，促进致病原被清除。（3）有研究认为MBP还可能参与了循环免疫复合物的清除。由于它能够激活补体系统和吞噬作用使得它从而构成人体的首道防线。

因此，MBP基因变异的研究具有重要的意义。我们的研究显示，在该地区人群中，MBP基因仅存在密码子54突变，未发现密码子52、57的突变。密码子54突变率，慢性乙肝组与健康对照组相比无统计学差异(P＞0.05)，而重型乙肝组则分别显著高于前两组〔χ2=7.79,P＜0.01,OR=3.36,95%CI(1.44-7.85),χ2=5.89,P＜0.05,OR=3.03,95%CI (1.23-7.44)P＜0.05〕。因此，MBP基因在我国仅存在密码子54突变。该突变与HBV的持续性感染无明显相关性，其原因为中国等亚洲人HBV感染慢性化的最重要因素在于胎儿期或儿童早期的病毒感染，在获得母体经胎盘分泌的HBeAg后，诱导了T细胞耐受，且感染的innoculum较大，在此机制下，婴幼儿的感染就成为了持续性感染[4]。而与重型肝炎的发生有关，其原因可能为：MBP基因产生变异，干扰了MBP的二级结构，产生无功能的蛋白质，导致血清MBP水平低下和调理缺陷，不能有效清除HBV及循环免疫复合物，大量免疫复合物沉积在肝脏，引起超强的免疫应答，造成肝细胞大量水肿坏死，从而导致重型肝炎的发生。Hakozaki等[5] 研究了MBP与HBV感染引起的暴发性肝衰竭预后的关系表明，存活者密码子54突变率(13%,3/23)比非存活者(40%,8/20) 低(P=0.043)。Yuen等[6]对香港人群的研究认为，乙肝患者血清MBP水平较正常人低下，MBP密码子54突变与慢性HBV感染者的疾病进展相关。Chong等[7]的研究也证实：HBsAg携带者中，低水平MBP与肝硬化及肝癌的发生有关。故监测MBP密码子54可作为肝炎患者病情预后的判断指标之一。不断明确重型肝炎的发生有着极为复杂的机制，寻找确切的病情预后判断指标以早期诊断早期治疗是为提高重型肝炎防治水平的重要手段和方向。

参考文献

1 Tong FY,Ma Xin,Zhu CW. MBP gene mutation and the relationship between infectious disease research progress. Foreign Medical Molecular Biology volumes，2003；25（2）：140~143.[童福易，马欣，朱传武。MBP基因突变与感染性疾病的关系的研究进展。国外医学分子生物学分册 2003；25（2）：140~143]

2 Summerfield JA,Sumiya M,Levin M,et al. Association of mutations in mannose binding protein gene with childhood infection in consecutive hospital series. BMJ. 1997;314(7089):1229-1232

3 Chinese Medical Association.The strategy of prevention and cure in viral hepatitis.Chin J Infect Dis,2001；19:56~62.[中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案。中华传染病杂志 2001，19：56~62]

4 Millich DR,Jones HE,Hughes JL,et al.Is a funtion of secreted HBe  antigen to induce immunologic tolerance in utero.Proc Natl Acad Sci U S A.1990;84:6599~6603

5 Hakozaki Y,Yoshiba M,Sekiyama K,et al. Mannose-binding lectin and the prognosis of fulminant hepatic failure caused by HBV infection. Liver. 2002;22(1):29-34.

6 Yuen MF,Lau CS,Lau YL,et al.Mannose binding lectin gene mutations are associated with progression of liver disease in chronic hepatitis B infection. Hepatology. 1999;29(4):1248-1251.

7 Chong WP, To YF, Ip WK, et al. Mannose-binding lectin in chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 2005；42(5):1037-1045

附图

图1  MBP基因DNA序列图谱（54密码子为GGC）

图2  MBP基因DNA序列图谱（54密码子为GAC）