根据乙型肝炎病毒（HBV）全核苷酸序列的差异，目前可将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型[1,2]。基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点，是病毒变异进化的结果。自1994年Okamoto[3]等首先报道HBV 基本核心启动子（BCP）ntA1762T/ntG1764A双突变以来，对其临床意义的研究方兴未艾，不同学者结论有所差异。本文旨在探讨HBV基因型与BCP ntA1762T/ntG1764A双突变的相关性。苏州市第五人民医院肝病科童福易

1 材料和方法

1.1 研究对象

    随机选取苏州市第五人民医院肝病科2007年门诊和住院的68例慢性乙型肝炎患者，HBV DNA检测均为阳性。诊断标准符合2000年西安会议修订的病毒性肝炎防治方案 [4]。其中男性42例，女性26例；年龄15～65岁。所有病例排除其它病毒感染和肿瘤及自身免疫病，未使用过免疫制剂。收集血清标本超低温冰箱保存备用。

1.2试剂及仪器

1.2.1 试剂: ①HBV BCP扩增引物为P1：5'-GTAGGACAGAGGGCATGCTC-3’；P2:5-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-3’,由上海生工公司合成，扩增片段包含nt1762、nt1764位点；②HBV基因分型荧光PCR检测试剂盒，由杭州博赛基因诊断技术有限公司提供；③DNA测序所需试剂：DNA提取试剂，上海基康生物技术公司；Ready-to-use PCR Kit，加拿大BBI公司产品；CEQTM DTCS-Quick Start Mix、Glycogen、CEQTMSample Loading Solution(SLS)、CEQTMSEPARATION BUFFER和MINERAL OIL，均由美国Beckman-Coulter公司提供；MinEuteTMPCR Purification Kit，德国QIAGEN公司产品；无水乙醇，常州武卫试剂厂；100mMEDTA和3MNaOAC，苏州肝病研究所配制。

1.2.2 仪器：Opticon 荧光定量PCR仪，美国MJ Research公司产品。ZWF-1型紫外透射发射分析仪，上海金达生化仪器厂；FS 600电泳仪，上海复生生物工程研究所；Sigma 3k-15 高速冷冻离心机,德国Sigma公司产品;GeneAmp9600基因扩增仪, 美国Applied Biosystems 公司生产。CEQTM8000基因测序仪，美国Beckman-Coulter公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1HBV DNA的提取

提取HBV DNA模板按试剂盒说明书进行操作。

1.3.2.HBV基因分型检测

采用HBV特异引物，利用核酸扩增、荧光标记探针，结合Taqman MGB探针技术，按试剂盒说明书操作，最后上样Opticon 荧光定量PCR仪检测分析。

1.3.3 BCP基因扩增

①吸取HBV DNA模板3ul，加入PCR Kit中的Mix（含p1、p2、Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+等）中，反应体系30ul，置GeneAmp9600基因扩增仪进行扩增。扩增条件为94℃预变性5min后，94℃变性30sec,56℃退火40sec,72℃延伸5min，循环35次，最后4℃保存。②取扩增产物5ul加入含有溴乙锭（0.5ug/ml）的2%琼脂糖凝胶，并设置DNA Marker，90V电泳15min。用紫外透射发射分析仪鉴定产物质量。③将扩增产物加入QIAquick纯化柱，按试剂盒说明书进行纯化。纯化产物即可用于测序反应。

1.3.3 BCP DNA序列测定

1.4 统计学方法

率的比较采用四格表X2检验。

2 结果

2.1 HBV基因型分布

    68例慢性乙肝标本中，测得B基因型20例（29.4%），C基因型46例（67.6%），B、C混合型1例，非B非C型（其它型）1例。

2.2 各基因型BCP ntA1762T/ntG1764A双突变发生率

    HBV BCP常见双突变位点，野生型为ntA1762、ntG1764，突变型为nt1762A→T、nt1764G→A。B、C两组基因型突变率比较见表1。除66例B、C两基因型外，另2例基因型的BCP也都为突变型。

表1 两组基因型BCP ntA1762T/ntG1764A突变率

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HBV分型  例数   突变型（ntT1762/ntA1764） 野生型（ntA1762/ntG1764）

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B       20         5(25.0%) *              15(75.0%)

C       46         24(52.2%)*             22(47.8%)

合计     66         29                     37

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* 两组比较，χ2=4.179，P＜0.05

3讨论

流行病学调查表明，HBV基因型分布存在明显的地区差异性【5】，B基因型与C基因型主要分布在亚洲【6】。我国主要以HBV C型和B型感染为主，南方以B型为主，北方以C型为主，也存在A型、D型及B和C型混合感染。目前认为，不同地区优势基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果。我们研究苏州地区的结果是B基因型20例（20/68,29.4%），C基因型比例最高，为46例（46/68,67.6%），尚有B、C混合型和非B非C型（其它型）。并不是前所述的南方以B型为主。肖扬等【7】对浙江温州地区966例患者HBV分型研究显示，66.46%为C型，20.49%为B型，B, C混合型为11.08%。欧强等【8】对上海地区部分乙型肝炎患者进行分析表明，C基因型占67.6%，B基因型占31.6%，D基因型1例。谢秀琴等【9】对江苏地区128例乙肝患者分型研究结果显示，该地区主要以C型（61.72%）和B型（37.5%）为主，仅发现1例B、C混合型（0.78%）。由上可知，本研究对于苏州地区乙肝患者HBV分型的结果与国内其他学者的结果基本一致，我国南方地区HBV基因型分布主要是C型和B型感染，但同样是以C型为主。而B、C型比例，B、C混合型所占的比例有所差异，这可能是由于样本差异及实验方法不同所致。

HBV的复制是以mRNA为中间体的逆转录复制，由于此过程缺乏校对酶，因此容易发生碱基配对错误，使得HBV基因突变较为频繁。随着对HBV基因型研究的深入，人们发现其基因型与基因变异之间似乎存在一定的相关性。有学者研究发现HBV C基因的基本核心启动子（BCP）T1762/A1764双突变与肝脏疾病的进展相关，而与HBeAg阳性或抗-Hbe阳性状态无关【10】。同时，也有报告认为BCP双突变可以减少前C区和C区的mRNA转录，从而使HBeAg表达受抑制，表现为HBeAg阴性。对于B基因型与C基因型，多数学者认为C基因型的HBV更容易发生BCPT1762/A1764双突变【11，12】。国内房继莲等【13】报告C基因型T1762/A1764双突变率为34.2%，明显高于B基因型的10.0%。我们的研究结果表明，HBV C 基因型发生T1762/A1764双突变率为52.2%，明显高于B基因型的25.0%，具有统计学差异，P＜0.05。这与多数学者的结果一致。另外，由于检测方法的差异，可导致BCP突变株和野生株混合感染率的差异。我国HBV感染率高达42.4%~80.7%，而转归差异大，可以为不受感染、暴发性肝炎、自限性肝炎或慢性感染以致进展为肝硬化及肝癌，HBV感染自然史多样性的原因与宿主的遗传背景及病毒的毒力有关【14】。我国患者大多属于难治性乙肝，从一个侧面来说，可能也与以C基因型为主，BCPT1762/A1764双突变率较高，HBV复制能力加强，毒力增加有关。但仍需进行大范围的多中心的严格的病例对照前瞻性研究进一步探讨它们之间的关系。由于基因分子生物学的不断发展，HBV基因型、基因变异与临床的关系将会得到逐步阐明。此有利于乙肝防治水平的进一步提高。

参考文献

1 Kimbi GC, Kramvis A, Kew MC. Distinctive sequence characteristics of subgenotype A1 isolates of hepatitis B virus from South Africa. J Gen Virol. 2004 May;85(Pt 5):1211-1220.

2 Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Hepatitis B virus genotypes and spontaneous hepatitis B e antigen seroconversion in Taiwanese hepatitis B carriers.
J Med Virol. 2004 Mar;72(3):363-9.

3 Okamoto H, Tsuda F, Akahane Y, et al. Hepatitis B virus with mutations in the core promoter for an e antigen-negative phenotype in carriers with antibody to e antigen.J Virol. 1994;68(12):8102-8110.

4 中华医学会传染病寄生虫病学会。病毒性肝炎防治方案。中华肝脏病杂志 2000，8（6）：324~329

5 Norder H,Hammas B,Lee S D,et al.Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen.J Gen Virol,1993,74:1341¬1348

6 Kao JH, Chen PJ, Lai MY, et al. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology, 2000,118(3):554-559.

7肖扬,周岳进,王开鉴,等. 浙江温州地区1020例乙型肝炎患者HBV基因分型研究。中西医结合肝病杂志,2005,15(1):41¬42.

8 欧强，陈良，唐徐英。上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析。检验医学，2007;22(1):31¬33

9谢秀琴,许家璋,李平,等。江苏地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义。疾病控制杂志,2005,9(2):171-173.

10.Kidd A H,Kidd-Ljunggren K.A revised secondary stucture model for the 3’-end of hepatitis B virus pregenomic RNA. Nucleic Acids Res,1996,24:3295¬3301

11 Sumi H, Yokosuka O, Seki N,et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease.Hepatology. 2003 Jan;37(1):19-26

12 Orito E, Mizokami M, Sakugawa H,et al.A case-control study for clinical and molecular biological differences between hepatitis B viruses of genotypes B and C. Japan HBV Genotype Research Group.Hepatology. 2001 Jan;33(1):218-23.

13 房继莲，魏来，李若冰，等。乙型肝炎病毒基本核心启动子及前C区突变与基因型的关系。中华微生物学和免疫学杂志，2004；24（6）：421~425

14 童福易，甘建和，陆芹，等。甘露糖结合蛋白基因突变与乙型肝炎的相关性研究。中华医学遗传学杂志，2008；25（3）：331~333