215007苏州市第五人民医院肝病研究所（童福易吴建鸿 曹文贵 吴兴福 费晓峰 丁龙其 ）

[摘要]目的：探讨乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)与HBV载量（HBV-DNA）的关系，为临床正确诊治提供科学依据。方法：采用免疫发光和荧光定量聚合酶链反应技术分别检测了670例患者血清中的HBV-M和HBV-DNA。结果：HBeAg阳性模式HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml占96.3%（363/377）, HBeAg阴性模式HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml占74.8%(160/214)。HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式(P＜0.05)。1,3,5模式HBV-DNA载量显著高于1,4,5模式（P＜0.01）。HBsAg 阴性的模式中：14例HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml占18.8%(12/64),抗-HBs阳性模式中，HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml占16.7%(7/42)。结论：HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式。但少数HBeAg阳性模式中病毒水平很低及HBeAg阴性模式病毒水平很高。还存在着HBsAg阴性或/及抗-HBs阳性的HBV感染。故临床上只有将HBV-M与HBV载量检测相结合，才能正确判断病情及预后。苏州市第五人民医院肝病科童福易

    [关键词] 乙型肝炎病毒；聚合酶链反应；荧光定量；酶免疫

Relationship between the models of serologic markers and the quantities of virus in patients infected with hepatitis B virus

Tong Fuyi,Shaowei,Cao Wengui,et al. Department of Infectious Diseases, Suzhou Fifth People’s Hospital, Suzhou 215007

[Abstract] Objective To understand the relationship between the models of serologic markers and the quantities of hepatitis B virus (HBV). Methods The serologic markers of HBV in 670 patients were detected by using the enzyme immunoassay and the quantities of HBV in  those were measured by using the real-time fluorescent quantitative PCR. Results The HBeAg-positive patients whose copies were more than 5.0e4 /ml accounted for 96.3%,and the HBeAg-negative patients whose copies were more than 5.0e4 /ml accounted for 74.8%.The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than HBeAg-negative patients(P＜0.05). The HBV copies of anti-HBe-positive patients were significantly less than anti-HBe-negative patients(P＜0.01).The HBV-DNA was detected in some HBsAg-negative (anti-HBs-positive or not) patients.Conclusions The HBV copies of HBeAg-positive patients were significantly more than HBeAg-negative patients. However, some HBeAg-positive patients’ HBV copies are very low, and some HBeAg-negative patients’ HBV copies are very high.The HBV-DNA even could be detected in some HBsAg-negative (anti-HBs-positive or not) patients.It is helpful to judge accurately prognosis by testing the serologic marker and the quantities of virus.

乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)为诊断乙型肝炎感染提供了重要依据,而HBV载量真实反映所感染HBV的数量，二者的关系是乙肝基础和临床研究中颇为关心的问题。由于近年来聚合酶链反应（PCR）技术的飞跃发展使定量PCR（Q-PCR）成为现实。我们采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检测了670例HBV感染者的HBV-DNA，探讨HBV-M与HBV载量的关系。

1 资料与方法

1.1 病例收集：670例均为我院2002年1月至10月的住院患者。所有病例近3个月未使用过特殊抗病毒药物，如干扰素、拉米夫定、α1胸腺素等。收集外周血，分离血清，当天检测或置-20℃保存。

1.2 HBV-M的测定：采用美国雅培（Abbort）公司的AXSYMTM自动化免疫发光诊断仪，试剂为Abbort提供的配套试剂，由专人操作。阳性报告方式：HBsAg（S/N）≥2.00；抗- HBs（Miu/ml）≥10.00; HBeAg(S/CO) ≥1.00; 抗- HBeAg(S/CO)≤1.00; 抗-HBc(S/CO)≤1.00。

1.3 HBV-DNA的定量测定：采用实时荧光定量PCR法。采用美国AcuGen System TMAG 9900 QRM Guantitation RoboMaster全自动定量PCR仪，试剂为AcuGen System配套试剂，由深圳百雅克泰（Biotronics）公司提供。检测灵敏度为5.0e4cps/ml。

1.4 统计学处理：率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 病例资料：共670例患者，男性515例，女性155例。男:女为3.3:1，年龄7~72岁，其中15~60岁占89.6%(600/670)。

2.2 HBV-M模式：共发现14种HBV-M模式。HBsAg阳性的模式8种共591例，占病例总数的88.2%(591/670),其中1,3,5模式占50.3%(297/591),1,4,5模式占30.6%(181/591)。HBsAg 阴性的模式6种共64例，占病例总数的9.6%(64/670)，其中2,4,5模式占34.4%（22/64）,4,5模式占23.4%（15/64）,2,5模式占21.9%（14/64）。HBV-M全阴性15例。

表 HBV-M与HBV-DNA载量的关系

Table 1 The relationship between the marker of HBV and the quantities of HBV

乙型肝炎病毒标志物 病例数          HBV-DNA载量 the quantities of HBV(cps/ml)    

the marker of HBV     n      ＜5.0e4(%)  5.0e4~4.9 e6(%)  5.0 e6~4.9 e8(%)  ＞5.0 e8(%)

                           (－)        （＋）        （＋＋）     （＋＋＋）

1,3,5               297      8(2.7)      69(23.2)       124(41.8)△       96(32.3)▲

1,4,5               181     46(25.4)     67(37.0)        55(30.4)△      13(7.2)▲

1,3,4,5              67      4(6.0)       20(29.9)        35(52.2)        8(11.9)

1,5                 23      6(26.1)      10(43.5)         4(17.4)        3(13.0)

1,2,3,5             11       1(9.1)        3(27.3)         4(36.4)        3(27.3)

1,2,4,5              9       1(11.1)       4(44.4)         3(33.3)        1(11.1)

1,2,3,4,5            2       1(50.0)       1(50.0)

1                  1       1(100.0)

2,4,5               22      18(81.8)      3(13.6)         1(4.5)

2,5                14      12(85.7)       2(14.3)

2                  5       4(80.0)       1(20.0)

2,4                1       1(100.0)

4,5                15      12(80.0)       1(6.7)                        2(13.3)

5                  7       5(71.4)       2(28.6)

全阴Negative      15      14(93.3)        1(6.7)

合计total          670     132            186            226            126       

* 1：HBsAg，2：抗-HBs，3：HBeAg，4：抗-HBe，5：抗-HBc。△：P＜0.05；▲：P＜0.01

2.3 HBV载量：HBsAg阳性的模式中：HBeAg阳性模式HBV-DNA＞5.0e4cps/ml占96.3%（363/377）,分析HBeAg阴性模式HBV-DNA＞5.0e4cps/ml占74.8%(160/214)。 HBeAg阳性模式HBV-DNA载量显著高于HBeAg阴性模式 (χ2=6.07,P＜0.05)。对于1,3,5模式，HBV-DNA＜5.0e4cps/ml仅占2.7%，而HBV-DNA＞5.0e4cps/ml占97.3%(289/297),其中HBV-DNA＞5.0e6cps/ml占41.8%(124/297)，HBV-DNA＞5.0e8cps/ml占32.3%(96/297)。1,4,5模式中，HBV-DNA＜5.0e4cps/ml占25.4%，而HBV-DNA＞5.0e4cps/ml占74.6%（135/181），其中HBV-DNA＞5.0 e6 cps/ml占30.4%，HBV-DNA＞5.0e8 cps/ml仅占7.2% 。1,3,5模式HBV-DNA载量显著高于1,4,5模式（P＜0.01）。HBsAg 阴性的模式中：14例HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml占18.8%(12/64),其中1例HBV-DNA＞5.0 e6 cps/ml，2例HBV-DNA＞5.0e8 cps/ml；抗-HBs阳性模式中，HBV-DNA＜5.0e4 cps/ml占83.3%(35/42)。其中2例HBV-M的5种标志同时存在。（见表）

3讨论

    感染HBV后HBV-M可表现为多种形式。本研究结果发现有14种抗原抗体模式。HBsAg阳性的模式中，最常见的为1,3,5模式（43.0%）。其次为1,4,5模式（40.7%）。HBsAg 阴性模式中，主要为1,5模式（29.1%）和2,4,5模式（27.8%）,其次为4,5模式（19.0%）和2,5模式（17.7%）。并发现2例HBV-M均为阳性。

    HBeAg是HBV基因组pre-C/C区段的mRNA表达，与HBV-DNA关系密切，故通常HBeAg阳性者病毒复制活跃，传染性强。HBeAg阴性者病毒复制水平低，传染性弱。我们的研究结果亦证实HBeAg阳性者HBV-DNA水平显著高于HBeAg阴性者（P＜0.05)。这与多数报道一致[1]。但在HBeAg阳性模式中，仍有3.7%的患者HBV-DNA＜5.0e4 cps/ml，可能是由于机体强大的免疫压力对HBV复制的抑制有关，或由于血液中的HBV-DNA整合到肝细胞中而致。在HBeAg阴性模式中，仍有74.8%的患者HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml，甚至有7.2%的患者HBV-DNA＞5.0e8 cps/ml，可能与HBV基因突变有关，特别是pre-C基因或C基因启动子发生突变时，e抗原难以表达，而仍存在病毒复制[2,3]。

HBsAg 消失，抗-HBs的产生，多意味着HBV感染的恢复或机体乙肝疫苗接种后产生了保护性作用。本研究结果表明HBsAg阴性、抗-HBs阳性模式中，仍有16.7%的患者HBV-DNA＞5.0e4 cps/ml，只是病毒水平多不高，可能与病毒复制水平低有关。HBsAg阴性的HBV感染是几年来临床关注的热点。其原因有：①抗原量过低，未达到可检测水平；②以抗原-抗体复合物存在，当抗体居优势时抗原被掩蔽，试剂盒不灵敏而不能被检出；③HBV-S基因变异，其中主亲水区有些变异不产生HBsAg[4]。可能是因为编码HBsAg的S基因发生变异：S基因“a”决定簇为主要抗原决定簇，此区单个保守的氨基酸替代可改变HBsAg的抗原性。“a”决定簇发生变异则影响整个抗体的应答。故用常规免疫诊断试剂检测出HBsAg，机体产生的抗-HBs并不能中和变异了的HBV。而且HBV存在不同亚型，分布具有地域性，“a”决定簇序列存在多态性[5]。故HBsA与抗-HBs并存并不奇怪，可能由于前后感染两种亚型HBV或S基因变异，原型抗-HBs不能清除抗原性已改变的HBsAg。我们的研究就发现，HBsAg阴性或/及抗-HBs阳性的少部分患者血清中亦存在HBV感染，且HBsAg、HBeAg滴度与HBV-DNA水平相关[6]。另外，抗-HBs检测结果不仅与试剂来源有关，还可能与所接种乙肝疫苗不同来源的差异有关[7]。

病毒复制过程中也同时表达包装蛋白，这些异源蛋白（抗原）激发机体免疫系统，产生相应的抗体。因此，抗原抗体反映了病毒的表达水平，也间接反映了病毒复制水平。血清学方法亦可用于乙肝病因分析（病原学诊断）、传染性、疾病进程和预后分析。但HBV的表达和机体的免疫反应的强弱受多种因素的影响，免疫学指标与临床现象及病毒载量有可能不完全符合[8]。由于HBV逆转录酶抑制剂的广泛应用，病毒变异的广泛存在，仅仅依靠免疫学指标已不能完全解释许多临床现象。血清学检测不能完全代替HBV-DNA检测。病毒载量是比血清学更加量化的指标，在反映临床现象及其变化趋势方面比血清学指标可能更加准确和灵敏。但二者不能互相完全替代。故临床检测HBV-M必须同时检测HBV-DNA水平，二者结合才能正确判断病情及预后，若只片面强调一方均有失偏颇。

参考文献

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infection with a quantitative PCR assay. Clin Diagn Lab Immunol 2000;7:298~300

2 Hunt CM, Mcgill JM, Allen MI, et al. Clinical relevance of hepatitis B viral mutations. Hepatology 2000;31:1037~1044

3 Fujiwara K, Yokosuka O, Ehata T, et al. The two different states of hepatitis B virus DNA in

asymptomatic carriers: HBe-antigen-positive versus anti-HBe-positive asymptomastic carriers. Dig Dis Sci 1998;43:368~376

4 骆抗先编著。乙型肝炎基础和临床。第二版。北京：人民卫生出版社，2001，334~335

5 童福易，白敬羽，唐永煌，等。苏南地区乙型肝炎病毒S基因序列的多态性研究。中西

医结合肝病杂志，2002；12（5）：260~262

6 邵伟，童福易，阮翠娟 。HBsAg、HBeAg滴度与HBV-DNA水平的关系。胃肠病学和肝病学

志，2003；12（5）：475~476

7 Heijtink RA, Schneeberger PM, Postma B, et al. Anti-HBs levels after hepatitis B immunization depend on test reagents: routinely determined 10 and 100IU/L seroprotection levels unreliable.Vaccine,2002,20:2899~2905

8 Weston SR, Martin P. Serological and molecular testing in viral hepatitis: an update. Can J

Gastroenterol,2001,15:177~184